4.5.1　黄酒酿造中杂醇的代谢与控制

杂醇是酒精发酵过程中产生的主要副产物，也是酒类主要的风味物质之一。黄酒中杂醇主要有以下几种：异丙醇、正丙醇、丙烯醇、异丁醇、正丁醇、叔丁醇、异戊醇、正戊醇、活性戊醇、甲基戊醇、苯甲醇和β-苯乙醇等，其在黄酒中的含量为205～700mg/L。含量适当的杂醇能使酒体醇甜，口感协调丰满，增加酒体的“骨架感”，给人以愉悦舒适感；另外杂醇在陈酿时与酸产生酯类化合物，进一步丰满酒体。若酒中杂醇含量过少，会使酒体寡淡，口感过于单薄。然而，当其含量超过一定限度时，会使酒体口感失调，产生不良风味，还会对饮用者产生强烈的致醉性。例如，β-苯乙醇是含量较高的醇类香气组分，与其他发酵酒相比，黄酒中含有更多的β-苯乙醇，然而当β-苯乙醇的含量超出一定限度时，会使黄酒产生不愉悦的气味。异戊醇占黄酒中杂醇总量的三分之一左右，具有微甜带苦的口感，含量过高会使酒的苦味和辣味增大，刺激口感增强，破坏酒体的圆润度和协调性。

杂醇的过量存在不仅仅是酒体中主要异杂味的来源之一，而且还会影响酒体的饮用舒适性。杂醇的LD₅₀、NOAEL和每日允许摄入量（ADI）如表4-4所示。由世界卫生组织（World Health Organization，WHO）的化学物质急性毒性分级（低毒：501～5000mg/kg）可知，杂醇不被看成是毒理学上具有严重危害的物质，且其肝毒性也远低于乙醇和乙醛。甚至欧盟还规定白兰地、果酒或朗姆酒必须含有至少125g/hL、200g/hL及225g/hL的纯醇类挥发性物质。然而，当其含量超出一定限度也会对人体产生一定的毒害作用。杂醇的中毒和麻痹作用比乙醇作用强，能使神经系统充血，人体代谢杂醇的速度比乙醇代谢慢，而且杂醇对人体的刺激作用时间会更长。研究表明正丙醇的毒性为乙醇的8.5倍，异丁醇的毒性为乙醇的8倍，异戊醇的毒性为乙醇的19倍，且具有典型玫瑰香味的β-苯乙醇含量过高的话会起到加醇作用，进一步加大黄酒的致醉性。杂醇对人体的影响主要表现在对大脑的麻醉和对细胞膜的溶解两个方面，且随着分子量的增大而增强。杂醇对人体的中枢神经有抑制作用，对交感神经、视觉神经等也会产生刺激，由于其在人体内分解速度很慢，在摄入过量的杂醇后还会引起头痛、头晕等不良症状。例如一定量的正丙醇对人体黏膜具有刺激作用；一定量的异丁醇对人体的眼、鼻具有刺激作用；一定量的异戊醇对人体的眼鼻同样有刺激作用（毒性比异丁醇大），过量时会导致神经系统充血、头疼眩晕、恶心呕吐，这是导致醉酒头痛、头晕的主要原因之一。目前黄酒中的杂醇总量并没有明确的限值标准，但是按照相同乙醇摄入量进行折算，黄酒中的杂醇含量要高于白酒、啤酒等酒精性饮料，这也能解释为什么饮用黄酒更容易“上头”。

4.5.1.1　酿酒酵母种类对发酵的影响

控制发酵酒品质最有效的途径是选择优良的酵母菌种进行酿造。但是由于不同的酵母菌种其生理特性不尽相同，在发酵过程中代谢副产物的种类及含量亦存在差异。目前对于酿酒酵母的研究，多集中在葡萄酒、啤酒、果酒酵母，而对黄酒酵母的研究较少。

已有研究对YZU01、YZU02、YZU03、STO1和SHO1酿酒酵母的乳酸脱氢酶活性进行研究，发现YZU03发酵乙醇产量最高，不同酿酒酵母菌株的乙醇生成量以及乳酸脱氢酶活性存在明显差异。江南大学对8种黄酒酵母进行分析，结果显示黄酒样品中挥发性组分含量的差异取决于不同黄酒酵母代谢特征的差异。在实际生产中发现，絮状酵母、新型酵母菌种以及传统强凝聚型发酵菌种发酵特性不一，但各有优势。

酵母种类也直接影响杂醇的种类和含量，黄酒独特的发酵工艺，使成品黄酒中杂醇的含量处于一个较高的水平（表4-5）。低产杂醇酿酒酵母可从多个方面获得，包括自然筛选、人工诱变、基因改造等。针对不同手段，以基因改造最为有效。通常做法是敲除酿酒酵母产杂醇的关键基因，使其不表达，从而降低杂醇含量。

酵母菌种是决定杂醇含量的主要因素，研究表明不同酿酒酵母杂醇生成量差异可高达50%～100%，降低杂醇最有效的手段便是选育低产杂醇的酵母菌株。啤酒发酵中杂醇是酵母在合成细胞蛋白质时产生的，即主发酵期随酵母繁殖而形成，通过敲除啤酒酵母中β-丙基苹果酸脱氢酶基因（LEU2），突变酵母菌株在发酵液中杂醇含量比出发菌株低，其中异戊醇的含量降低明显，而酒精度、发酵速度等发酵性能没有明显变化。基因改造酵母菌株实验结果表明类丙酮酸脱羧酶（YDL080C）基因缺失工程菌的异戊醇含量与亲本相比没有明显变化，LEU2缺失工程菌的异戊醇含量降低16.16%。有学者进行了酿酒酵母ILV5与ILV2、ILV3等基因同时过表达对杂醇合成影响的研究，结果发现这些基因共同过表达提高了异丁醇的含量。使用酿酒酵母氨基酸转氨酶编码基因BAT2完全缺失突变株进行小曲酒酿造时，半固态发酵杂醇显著降低，固态发酵杂醇无显著变化。尿素、硫铵、糟水能降低发酵过程中的杂醇，添加硫铵时乙醇含量有所降低。研究表明不同种类酵母中，杂醇的生成量以葡萄酒酵母最多，其次为酒精酵母、啤酒酵母，一定范围内改变酵母添加量对杂醇的影响并不显著。

4.5.1.2　酿酒酵母中杂醇产生的代谢途径

杂醇是酿酒酵母在生长代谢过程中合成细胞所需蛋白质时产生的副产物，黄酒中的杂醇以异丙醇、异丁醇、正戊醇、异戊醇、β-苯乙醇为主，形成途径主要有两条——Ehrlich途径和Harris途径。

德国化学家Ehrlich于1907年提出通过氨基酸降解代谢途径可形成杂醇，该代谢途径认为在发酵基质中，支链氨基酸通过转氨酶的作用进行脱氨基反应，脱氨后转移到α-酮戊二酸上进而形成相应的α-酮酸，α-酮酸在脱羧酶的作用下进行脱羧、还原反应，形成比原氨基酸少1个碳原子的杂醇（图4-16）。

1953年Harris提出了杂醇的合成代谢途径，即杂醇的合成是酿酒酵母在发酵基质中，通过糖酵解途径（EMP）形成丙酮酸，在乙酰羟酸合酶的作用下丙酮酸进入氨基酸的生物合成途径，在合成代谢的最后阶段形成α-酮酸中间体，在相应酶的催化下进行脱羧还原，形成相应的杂醇（图4-17）。

在发酵过程中杂醇的产生不可避免，因此适当控制酒体中杂醇的含量至关重要。酵母细胞中两条代谢途径产生的杂醇含量存在一定的比例，由于合成代谢途径中产生的丙酮酸较易转变为低分子的α-酮酸，所以大部分低碳链杂醇来自于合成代谢途径产生的α-酮酸。已有研究认为酒类杂醇中的异戊醇、异丁醇和活性戊醇，75%来自糖代谢，25%来自相应的亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸的Ehrlich路径。但是近些年的研究发现酵母吸收的所有氨基酸均先进行脱氨变成相应酮酸，然后再根据胞内营养需求进行转变，所以也有研究认为营养丰富环境中绝大部分杂醇来自于Ehrlich路径。

4.5.1.3　酿酒酵母中杂醇合成相关基因

对酿酒酵母产杂醇相关基因进行基因工程改造，是研究杂醇合成影响因子的有效方法。通过分子生物学手段改变酿酒酵母杂醇代谢途径的相关基因，从而改变酶活特性得到理想的实验结果。研究者通过敲除或过表达杂醇相关基因，以改变酿酒酵母产杂醇的能力。

对酿酒酵母产杂醇的关键基因分析发现，关键基因的调节对杂醇的产量有着明显影响。侧链氨基酸转氨酶基因（BAT1、BAT2）的缺失或过表达能够显著影响杂醇的含量。而BAT1、BAT2基因在低可同化氮素水平下表达上调，而在高可同化氮素水平下表达受到抑制。BAT基因的过量表达能够减少异丁醇和异戊醇前体物质乙偶胭的含量。通过对芳香族氨基酸转氨酶（ARO8、ARO9）的研究发现，芳香族氨基酸在菌体生长时需要在芳香族氨基酸转氨酶Ⅰ（ARO8）催化下进行脱氨反应。芳香族氨基酸转氨酶Ⅱ（ARO9）是一种诱导酶，在菌体生长时合成代谢中通常不表达，当生长环境存在诱导物，氨效应能够抑制ARO9的表达。此外脱羧酶是酿酒酵母（S.cerevisiae S288C）中β-苯乙醇生物合成途径的关键酶之一，增加ARO10的基因表达量有利于提高β-苯乙醇产量。异戊醇是杂醇的重要组成部分，通过构建酿酒酵母类丙酮酸脱羧酶基因（YDL080C）缺失的工程菌株，发现酿酒酵母缺失YDL080C基因对杂醇产量没有明显作用，特别是异戊醇。通过对酿酒酵母基因（KDC、ILV2以及ADH6）进行过表达，同时敲除丙酮酸脱羧酶1基因（PDC1），异丁醇的产量会显著提高。通过敲除线粒体中缬氨酸合成基因（ILV2、ILV3以及ILV5），在细胞质中构建缬氨酸的生物合成途径，同时过表达ARO10和ADH2基因，结果发现提高了异丁醇的产量。有研究发现在厌氧条件下同时过表达细胞质中缬氨酸代谢途径基因（ILV2、ILV3以及ILV5）和支链氨基酸转氨酶基因（BAT2），酵母厌氧生成异丁醇的产量增加。在酿酒酵母细胞质中构建缬氨酸合成途径，过表达ILV2、ILV3以及ILV5，同时过表达KivD和乙醇脱氢酶基因（ADH6）能够增加异丁醇产量。THR4基因缺失会提高酿酒酵母正丙醇生成量，但是不会改变异丁醇的含量。酿酒酵母氨基酸透性酶基因（BAP2）具有底物识别特异性，能够同化缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸形成杂醇。此外添加赖氨酸能够提高SPS诱导基因AGP1的表达。酿酒酵母氮代谢途径中相关基因的第2个激活因子GAT1，高浓度谷氨酸抑制GAT1的表达，GAT1能在铵盐培养基中被激活。

在酿酒酵母细胞中，杂醇合成受发酵体系中氮素营养状况调控。氨基酸营养充足时，氨基酸经细胞质支链氨基酸转氨酶（BCAT）作用脱氨生成α-酮酸，进一步在α-酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶作用下，生成杂醇（图4-18）。研究发现，BCAT的编码基因BAT2低表达及缺失显著降低了发酵产物中杂醇含量。该反应过程需要TCA循环提供氨基受体α-酮戊二酸。氮源的耗尽触发EMP途径关键酶（磷酸果糖激酶、己糖激酶等）诱导表达，葡萄糖代谢活跃，生成大量的丙酮酸，丙酮酸经异构、脱氢、脱羧等反应生成α-酮酸，最后生成杂醇。

4.5.1.4　杂醇的控制措施

降低杂醇最有效的手段便是选育低产杂醇的酵母菌株，低产杂醇酿酒酵母可从多个方面获得，包括自然筛选、人工诱变、基因改造等。针对不同手段，以基因改造最为有效。通常做法是敲除酿酒酵母产杂醇的关键基因，使其不表达，从而降低杂醇含量。但是基因工程菌株在酿酒工业应用存在争议。

选择蛋白质含量较低的糯米原料进行黄酒酿造，或者通过提高原料的精白度除去部分蛋白质，也可通过降低浸泡温度使蛋白质部分分解。这是由于杂醇的代谢产生跟氨基酸的含量有关，减少蛋白质含量可减少氨基酸的含量，进而降低最终杂醇的生成量。

控制合适的主发酵温度和后发酵温度。因为温度过高不仅会加速酵母体内氨基酸发生脱氨基作用，还会加快酵母自溶，发酵体系中产生过多的氨基酸导致杂醇含量上升。温度过低则会抑制酵母的增殖，因此要控制合适的温度使整个发酵体系处于平衡状态。

除了酵母菌株，可同化氮素（yeast assimilable nitrogen，YAN）也是影响杂醇生成的关键因素。可同化氮素是指酿酒酵母在发酵过程中优先被利用的氮素，包括无机氮（铵态氮等）、有机氮（游离α-氨基酸和小分子多肽等）。可同化氮素与杂醇的形成有着密切的联系，在酿酒酵母细胞中，杂醇的合成受发酵体系中氮素营养状况调控。在氨基酸充足的条件下，氨基酸经细胞质支链氨基酸转氨酶（BCAT）作用脱氨生成α-酮酸，后进一步经脱羧、脱氢反应形成杂醇（图4-18）。当氨基氮源缺乏时，杂醇的代谢受到酮酸溢出机制调控（图4-19）。氨基氮源的耗尽能够触发EMP途径关键酶诱导表达，使得葡萄糖代谢活跃，生成大量丙酮酸，在氨基供体缺乏时，经过异构作用进一步脱羧、脱氢形成杂醇。

从代谢的初始阶段来看，丙酮酸参与酿酒酵母细胞中多种代谢途径，可看作是初始产物。一方面，葡萄糖经EMP途径，不断分解形成丙酮酸；另一方面，丙酮酸参与TCA循环以及合成杂醇的途径等，在此过程中被消耗。丙酮酸在酵母细胞中的浓度可看做两者之差，若丙酮酸含量过高，就会向合成杂醇的方向进行。这两条代谢途径对杂醇形成的作用大小不同，发酵体系中可同化氮源的组成和含量影响杂醇的含量，当缺乏可同化氮素时，糖合成途径以合成氨基酸占优，此时氨基酸合成中间体酮酸会合成较多的杂醇；但是随着升高可同化氮源的浓度，合成途径中酶的活性会受到高浓度的氨基酸反馈抑制，从而降低了杂醇在合成途径的形成量，同时使分解代谢途径形成的杂醇量增加。当氮素营养充足时，杂醇的生成主要是Ehrlich途径；而氮素营养缺乏时，杂醇的生成主要是Harris途径。酵母在可同化氮素含量过低的发酵液中，合成细胞蛋白质的氨基酸需通过糖代谢合成途径摄取，因此产生较多的杂醇。杂醇在糖合成途径需要经过丙酮酸合成高级酮酸，进一步形成杂醇。乳酸脱氢酶可以催化丙酮酸向乳酸转化，但是该反应需要丙酮酸和还原性辅酶的参与，且反应是可逆。较低的可同化氮素会减弱酵母菌发酵活力，使葡萄糖代谢α-酮酸过剩，进而还原形成杂醇；相反，高含量可同化氮素则会减少杂醇产生。因此可以根据氮素和杂醇之间的关系，通过调节氮素来调控黄酒中杂醇的含量。

国内外对于可同化氮素在葡萄酒与果酒领域研究比较深入，在葡萄酒的酿造过程中，适当添加可同化氮素是降低杂醇含量的有效手段之一。但是对于黄酒发酵过程中可同化氮素的研究相对较少。一方面黄酒属于双边发酵，这也是与葡萄酒、果酒以及啤酒的主要差别；另一方面黄酒属于多菌种半敞开式发酵，其发酵特点比较独特。在黄酒发酵过程中，酵母的生长需要大量蛋白质，而合成蛋白质所需的氨基酸需从环境中摄取以及自身合成。许多研究表明在葡萄酒发酵前期添加氮源，有利于酒体中杂醇含量以及整体风味的控制。对于是否为优先利用氮源，可以通过酵母菌数量的增加速率以及利用某种氮源后阻遏效应能否被消除以此来判断。

早期研究发现在合适的氮源范围内，杂醇的浓度与发酵液中初始氮素的浓度成反比。葡萄汁中的铵盐能够被酵母菌利用合成自身的氨基酸，如果发酵体系中铵盐是唯一的氮素，则杂醇的产量低；如果含有足够的游离氨基酸，杂醇产量较高。当发酵体系中有无机氮素存在时，杂醇的形成则会被阻止或延缓。对于可同化氮素的添加，很多研究集中在无机氮源和有机氮源。向葡萄酒发酵液中添加磷酸氢二铵，在发酵体系中α-氨基氮总量控制在190mg/L时，能产生较低的杂醇。硫酸铵的添加能够降低合成培养基中杂醇的含量，且在发酵前添加明显降低杂醇含量。除无机氮源外，有机氮源也可作为调控杂醇的物质，如在葡萄酒发酵过程中添加亮氨酸能显著降低发酵汁中杂醇含量，而杂醇的生成量受甘氨酸影响不明显。缬氨酸的添加会导致异丁醇含量的增加，而亮氨酸和异亮氨酸的添加均会使异戊醇的含量显著增加，且β-苯乙醇的含量会受到亮氨酸添加的影响。精氨酸处理能减少酒精和生物胺产量，谷氨酸添加对酒精产量无显著影响但生物胺总量增加，添加400mg/L的谷氨酸，酒醪中的乙酸乙酯含量最高。

目前国内外研究可同化氮素添加主要集中在葡萄酒中杂醇，而不同种类可同化氮素之间，不同酒类之间研究较少，目前关于可同化氮素的添加对黄酒杂醇的影响研究也相对较少。可同化氮素含量不足会造成发酵缓慢和中止等问题，通常的解决办法是向葡萄汁中添加无机氮磷酸氢二铵，但是过量的氮素添加可能会造成葡萄酒质量的潜在危险。在实践中，澳大利亚和新西兰食品标准中磷酸氢二铵的最大添加量为400mg/L（以磷计），相当于360mg/L YAN；而在欧洲和美国法律限定添加磷酸氢二铵或硫酸的范围分别为1000mg/L和950mg/L；在中国作为饼干膨松剂允许最大残留量为2.5g/kg。当葡萄汁可同化氮素含量超过500mg/L时，发酵葡萄汁中会造成氮残留，造成微生物危害及形成生物胺、氨基甲酸乙酯。磷酸氢二铵单独作为氮源发酵不会产生氨基甲酸乙酯，用其替代缺失的氨基酸不会影响正常发酵过程。江南大学研究，通过添加可同化氮素能够显著影响黄酒酵母杂醇合成相关基因的表达，在酵母稳定生长期，200mg/L YAN（以氮计）添加处理条件下，多数基因表达上调；在酵母停滞生长期和对数生长期，400mg/L YAN添加处理条件下，多数基因表达下调。在黄酒发酵前期添加（NH₄）₂HPO₄、NH₄Cl能够显著降低杂醇，是降低杂醇的优质氮源。在发酵基质中添加缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸能分别提高异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇的含量，而添加精氨酸、谷氨酸有降低杂醇的趋势。但是不同黄酒酵母、不同发酵工艺的黄酒需要采用不同的氮源添加策略，如黄酒酵母Y1739的最佳添加策略是前酵加入NH₄Cl 400mg/L YAN，能使总杂醇降低36.88%；黄酒酵母Y1615的最佳添加策略是前酵加入NH₄Cl 200mg/L YAN，总杂醇降低36.70%；黄酒酵母Y1701的最佳添加策略是前酵加入（NH₄）₂HPO₄ 300mg/L YAN，总杂醇降低39.73%。氮源添加对成品酒中氨基酸、生物胺、乙醇、有机酸等物质含量没有显著影响，但是除杂醇外的挥发性风味物质有所增加。

4.5.1.5　氮源添加对黄酒酵母合成杂醇关键基因的影响

qPCR检测技术操作简单、反应灵敏、特异性强、准确定量，可同时针对基因的不同状态进行检测。此外，qPCR技术针对微生物的不同功能基因、不同处理条件（如物理、化学、外源添加物等）以及不同发育阶段的基因表达差异进行检测，研究各基因在细胞中的表达丰度，分析基因的表达调控、mRNA的表达模式等，结果真实可靠，能够正确反映出基因的表达状况。因此，在不同的氮源浓度添加条件下，可以利用qPCR研究Y1615的杂醇相关基因表达状况。

（1）氮源添加对合成杂醇相关基因表达的影响

通过对实验组进行不同氮源添加量的实验，分别设置0mg/L YAN、200mg/L YAN、400mg/L YAN氮源添加组。并对黄酒酵母在停滞生长期、对数生长期和稳定生长期进行取样，提取不同阶段的黄酒酵母总RNA。利用7900 HT Fast Real-Time PCR System进行qPCR实验，得出处理组相对空白组的各基因相对转录水平。

不同氮源浓度添加条件下的杂醇代谢途径的相关基因有很大的差距。首先在200mg/L YAN氮源添加条件下（图4-20），黄酒酵母在不同生长阶段的基因相对转录水平有着明显的变化。在停滞生长期BAT1、BAT2、ARO9、LEU2、GAP1、AGP1、BAP2基因表达上调，其余5个目的基因表达下调，而作为糖合成途径中的α-乳酸乙酰合成酶基因ILV2、ILV3以及合成芳香族氨基酸的预苯酸脱水酶基因PHA2的表达下调，说明停滞生长期氮源足够，主要走氨基酸合成途径。Gemma等研究表明，黄酒酵母增长在停滞生长期偏向使用铵盐，而在稳定生长期一般利用有机氮源氨基酸用于生长代谢。造成基因表达变化的主要因素可能是由于氮源的添加造成合成途径的反馈作用。

在对数生长期仅有BAT1、ILV2、ILV3、LEU2、BAP2基因表达上调，其余7个基因表达下调；而在稳定生长期BAT1、BAT2、ILV2、ILV3、ARO8、LEU2、BAP2基因表达上调，其余基因表达下调。黄酒发酵过程中，氨基酸的含量总体呈现“先急后缓”趋势，前期增长幅度大，后期增长缓慢。说明生长期基因表达增强以合成细胞所需的氨基酸。研究发现BAT1、LEU2、BAP2在黄酒酵母的各个生长阶段基因表达上调，根据石钰等研究，说明氮的添加能影响异丁醇、异戊醇的含量；而仅有PHA2、TAT2基因在整个生长阶段表现下调，说明氮源的添加可能会降低芳香类物质合成。

在400mg/L YAN添加条件下（图4-21），黄酒酵母在不同生长阶段的基因相对转录水平有着明显的变化，但与200mg/L YAN添加条件下有着很大的差距。说明氮源的浓度对杂醇基因的表达有影响。在停滞生长期，BAT1、ILV2、ILV3、ARO9、PHA2、LEU2、GAP1基因表达上调，其余5个实验基因表达下调。在对数生长期，仅有BAT1、PHA2、GAP1基因表达上调，其余9个基因表达下调。说明对同一生长阶段的酵母菌进行氮源作用，杂醇基因表达方式不同，这与已有研究有着相似之处。

在稳定生长期PHA2基因表达下调，而其余基因表达上调。研究发现BAT1、GAP1在黄酒酵母的各个生长阶段基因表达上调，没有整个生长阶段表现下调的相关基因。

在停滞生长期（图4-22），基因BAT1、ARO8、ARO9、LEU2、GAP1、TAT2在不同的氮源浓度添加条件下表现出相同的趋势。基因ARO9在200mg/L YAN相对于400mg/L YAN上调明显，基因GAP1在400mg/L YAN相对于200mg/L YAN上调明显，基因TAT2在400mg/L YAN下调明显。

在对数生长期（图4-23），基因BAT1、BAT、ARO8、ARO9、AGP1在不同的氮源浓度添加条件下表现出相同的趋势。基因BAT1在200mg/L YAN相对于400mg/L YAN上调明显，基因BAT2、ARO8、TAT2在400mg/L YAN相对于200mg/L YAN下调明显。说明在对数生长期氮源的添加可能会导致代谢途径的反馈抑制。

在稳定生长期（图4-24），除基因ARO9、PHA2、GAP1、AGP1、TAT2在不同的氮源浓度添加条件下表现出不同的趋势外，其余基因均表现出相同的表达趋势。基因BAT1、BAT2、ILV2、ARO8、ARO9、GAP1、AGP1、TAT2在400mg/L YAN相对于200mg/L YAN上调明显，分析原因可能是因为在稳定生长期氮源浓度相对于停滞生长期的浓度低，适宜的浓度促使基因表达，这与秦伟帅等研究一致。但此时黄酒酵母已达到稳定生长期，酵母代谢水平相对稳定，产生较少的杂醇。

综合以上分析可知，杂醇的合成基因受到氮源浓度的调控。在酵母稳定生长期，200mg/L YAN添加处理条件下，多数基因表达上调；在酵母停滞生长期和对数生长期，400mg/L YAN添加处理条件下，多数基因表达下调。说明氮源的添加能显著影响杂醇基因表达，进而改变杂醇含量。

（2）不同黄酒酵母产杂醇特性

杂醇是黄酒酵母生长代谢过程中的重要副产物。发酵液中适量的杂醇能够增加酒体的醇厚感，但是较多杂醇的产生是不利于酒体整体风味的。黄酒酵母的品种是决定杂醇产量的重要因素，因此实际生产中筛选优良的酵母品种，是减少发酵体系中杂醇的重要措施。

研究发现（图4-25），Y1739、Y1615、Y1701杂醇的代谢产量存在差异，3株黄酒酵母杂醇主要为异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇，占总杂醇的80%以上，与已有研究具有相似结论。其中Y1739杂醇总量最高，Y1615杂醇含量最低。但是，Y1739产生杂醇中异戊醇占有较高的比例，而Y1615、Y1701产生杂醇中β-苯乙醇占有较高的比例。造成酵母杂醇差异主要是与黄酒酵母自身代谢特性有关。有研究表明，不同酵母的乳酸脱氢酶（LED）活性与杂醇有很大的关系，乳酸脱氢酶的活性与杂醇的产量呈正比。此外黄酒酵母支链氨基酸转移酶、芳香族氨基酸转移酶、异丙基苹果酸合成酶、α-乙酰乳酸合成酶、苯酸脱水酶活性的不同，均会影响杂醇的最终产量。因此根据黄酒酵母特性进行基因的定向改造，是控制杂醇产量的重要手段。

综合不同酵母的发酵特性分析可知，不同黄酒酵母在发酵过程中的生物量、产酸、产乙醇以及糖消耗等方面都存在一定的差距，而且对于杂醇不同黄酒酵母之间差异性更为显著，这也说明酵母的差异是决定杂醇含量的重要因素。因此为降低发酵酒中的杂醇，针对不同黄酒酵母选择不同的氮源调控措施值得被研究。

（3）不同氮源对黄酒产杂醇的影响

可同化氮素是酵母菌正常发酵时所必需的大量营养元素。在黄酒发酵过程中，黄酒酵母主要利用发酵液中的有机氮源和无机氮源来提供自身合成代谢所需要的氮元素。有机氮源主要指氨基酸类，而无机氮源主要是指铵盐类。在发酵体系中只有8种氨基酸能被酵母菌迅速同化利用，酵母菌必须依靠本身生物合成不能被同化的氨基酸。此外，铵盐类也是酵母菌优先利用的氮源。在发酵体系中，根据氮源、黄酒酵母以及杂醇三者之间的关系，通过添加氮源以达到降低杂醇的目的。

①不同种类氮源对黄酒酵母生长的影响

可同化氮素是黄酒发酵中酵母所需的重要营养物质之一，可同化氮素含量低不仅导致酵母菌数量低，还增加发酵延缓和中止的危险性。不同可同化氮素添加条件下的酵母生长情况见图4-26。

从整体结果来看，在发酵初期添加不同的可同化氮素，酵母的生长趋势基本相同，但是酵母Y1615比Y1739具有更好的长势。发酵过程中Y1615酵母OD₆₀₀值最高，Y1701酵母OD₆₀₀最低，这取决于酵母自身的发酵特性。而对于Y1739，在磷酸氢二铵、碳酸氢铵、尿素条件下，酵母表现出更好的生长趋势，其余组别无明显差距。对于Y1615，除硫酸铵、氯化铵外，其余组别无明显差距。对于Y1701，在磷酸氢二铵、碳酸氢铵、尿素条件下，与Y1739生长趋势相同，酵母表现出较好的长势，其余组别无明显差异。而对于3株酵母在氯化铵的添加条件下，相对于对照组酵母数量有所下降。分析原因可能是由于不同黄酒酵母对可同化氮素的嗜好性不同，优先利用的氮源更有利于酵母的生长。B.Magasanik表明铵盐的偏好性具有一定的菌株特异性，不同酵母氮源偏好性不同，不同氮源也偏向不同酵母菌种。与此同时添加不利于黄酒酵母生长的氮源，可能会发生氮源去阻遏效应，影响黄酒酵母的正常生长。

②不同种类氮源对黄酒酵母产杂醇的影响

不同黄酒酵母产杂醇组成基本相同，3株黄酒酵母中异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇含量占据了杂醇的大部分，但是不同酵母发酵产生的杂醇含量存在着明显的差异，在实验条件下，Y1739产异戊醇高于β-苯乙醇的含量，而Y1615与Y1701产β-苯乙醇的含量高于异戊醇的含量，原因可能是Y1615与Y1701的β-苯乙醇代谢途径要强于Y1739的β-苯乙醇的代谢途径；同样异戊醇的代谢途径也存在着相同的关系，与陈双等研究不同地区的酵母产β-苯乙醇具有类似的结果。添加氮源后异丙醇的产生有很大的变化，Y1739产异丙醇含量对照组0.06mg/L、铵盐组0.11～0.18mg/L、氨基酸组0.06～0.08mg/L。而Y1615异丙醇和异戊醇并无明显变化，这与Garde等通过向氮源缺陷性菌株中添加铵盐和不同含量的氨基酸，结果发现杂醇含量受氨基酸添加的影响不显著的结果一致（图4-27～图4-29）。

从整体实验结果可知，可同化铵盐类的添加均有利于杂醇的降低，而氨基酸类的氮源添加却表现出不同的结果，其中L-苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸的添加分别使得β-苯乙醇、异丁醇、异戊醇增高，这与韩涛等研究亮氨酸的添加对影响杂醇最为显著，而缬氨酸影响次之，甘氨酸的影响最小等结果类似。与Hern􀅡ndez等研究了可同化氮素对3种酵母菌种发酵的影响，铵态氮添加使异戊醇的含量降低，氨基酸的添加显著增大了葡萄酒中异丁醇的含量结果相符。与Losada等研究发现在葡萄汁中异戊醇的含量随着铵盐或氨基酸含量的增加显著降低也存在相似的结果。

在发酵过程中可同化氮素的添加，对黄酒酵母产杂醇有着重要的影响。3株不同的黄酒酵母发酵结束后，铵盐类降低杂醇效果明显，而氨基酸类添加后，杂醇则表现出不同的形式。但是对于Y1739铵盐降低杂醇效果大小顺序（氯化铵、硫酸铵、磷酸氢二铵、碳酸氢铵、尿素）与Y1615铵盐效果顺序（氯化铵、磷酸氢二铵、碳酸氢铵、硫酸铵、尿素）存在差别，此外有别于Y1701铵盐降低效果顺序（硫酸铵、氯化铵、尿素、磷酸氢二铵），这说明酵母种类也是产生杂醇的关键因素，也间接证明铵态氮是酵母可同化氮素的主要成分，是黄酒酵母优先利用的无机氮源。Y1739发酵结束后除L-苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸外，相对于对照组可同化氮素的添加降低杂醇效果明显，铵盐的添加有助于降低杂醇含量。氯化铵添加后杂醇降低了62.60%，但是L-苯丙氨酸添加后杂醇增加了0.25倍，缬氨酸添加后杂醇增加了0.46倍，亮氨酸添加后杂醇增加了0.20倍。这可能是特定氨基酸的添加，促使Ehrlich转化途径增强。Y1615发酵结束后除L-苯丙氨酸、亮氨酸外，均有降低杂醇的效果，但是铵盐类优势更加明显，这与Y1739具有相同结论。其中氯化铵添加后杂醇降低了63.15%，而添加L-苯丙氨酸后杂醇增加了1.05倍，说明L-苯丙氨酸的添加能显著增加杂醇的含量。这与林朴研究随氨基氮的增多，杂醇的生成量表现为先降低后升高的变化趋势的结果不一致，分析结果可能是杂醇的含量与培养基的氮源浓度相关。而Y1701发酵结束，硫酸铵降低效果最为明显，其次是氯化铵、谷氨酸。进一步说明可同化氮素对酵母杂醇的产生有着重要的影响，不同可同化氮素的作用模式值得探讨。

综合酵母生长、乙醇产生以及杂醇含量变化进行评价可知，在磷酸氢二铵、碳酸氢铵、尿素条件下，酵母Y1739和Y1701长势较好，而Y1615生长差异不显著。在磷酸氢二铵、氯化铵条件下，Y1739乙醇含量显著增加（p<0.05），而Y1615和Y1701乙醇产量差异不显著（p>0.05）。此外，在磷酸氢二铵和氯化铵的条件下，也具有较好的降杂醇效果。因此，确定磷酸氢二铵、氯化铵作为下一步探讨的对象，并进一步优化。

（4）降杂醇氮源的筛选及条件优化

利用发酵模拟液进行纯种发酵，便于研究黄酒酵母发酵特性，对模拟发酵过程进行2种氮源和5个浓度梯度处理，发酵结束时进行理化指标分析。可以验证氮源添加对黄酒酵母的作用，以排除其他微生物的影响，更好地阐明氮源的作用机理。

①在Y1739发酵体系中可同化氮素添加量优化

模拟液经（NH₄）₂HPO₄处理结果发现（表4-6），除对照组（CK）外，随着添加浓度的提升，发酵液中还原糖、总酸、pH均有上升的趋势。（NH₄）₂HPO₄属中强酸弱碱盐，其水溶液呈碱性，这是总酸和pH变化的主要原因。此外发酵过程中的酵母数量表现正常，处理组之间乙醇含量并无显著差异。

经NH₄Cl处理后，随着氮源浓度的提升，发酵液中还原糖变化与（NH₄）₂HPO₄处理结果类似，总体趋势均表现上升。但是总酸、pH的变化与（NH₄）₂HPO₄处理结果表现不同，通过100～400mg/L YAN的添加，总酸和pH表现出降低的趋势。NH₄Cl属强酸弱碱盐，其水溶液呈酸性，这也是NH₄Cl与（NH₄）₂HPO₄总酸和pH差异的主要原因。另外，（NH₄）₂HPO₄添加条件下，200mg/L YAN处理乙醇含量较高，说明适当的氮源添加可促进乙醇产生。其余实验组乙醇含量与对照组乙醇含量无显著差异。NH₄Cl添加条件下，实验组乙醇含量高于对照组，可能是NH₄Cl添加能够促进黄酒酵母Y1739的乙醇产量。

氮源添加对杂醇的作用模式不尽相同，各种杂醇的含量变化与氮源种类及浓度有很大的区别。不同氮源处理杂醇基因的表达方式不一，杂醇含量的变化不同。

经（NH₄）₂HPO₄处理前酵结束［图4-30（a）］，发酵液中的异丙醇和戊醇含量较少，且变化不明显。异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇是模拟发酵过程中产生的3种主要杂醇。其中异丁醇在300mg/L YAN的条件下最低，实验组（11.66mg/L）相对于对照组（40.68mg/L）降低71.34%。异戊醇在200mg/L YAN的条件下最低，实验组（116.08mg/L）相对于对照组（127.78mg/L）降低9.16%。β-苯乙醇在300mg/L YAN的条件下最低，实验组（104.44mg/L）相对于对照组（141.36mg/L）降低26.12%。总杂醇在300mg/L YAN氮源处理下含量最低，总杂醇（实验组309.86mg/L、对照组237.62mg/L）相对降低23.31%。

经（NH₄）₂HPO₄处理后酵结束［图4-30（b）］，发酵液中杂醇含量有所降低。可能原因一方面是因为少量的挥发，另一方面是后期的酯化反应促进杂醇的消耗。这也是陈化过程中黄酒杂醇减少的主要原因。后酵结束在400mg/L的条件下，杂醇降低明显。异戊醇（实验组89.33mg/L、对照组146.52mg/L）相对降低39.04%。β-苯乙醇（实验组36.48mg/L、对照组51.60mg/L）相对降低29.30%。总杂醇（实验组299.31mg/L、对照组212.92mg/L）相对降低28.86%。但是异丁醇含量高于对照组，且总杂醇的减少量在300mg/L YAN和400mg/L YAN的添加条件下，无显著性差异（p>0.05）。

经NH₄Cl处理前酵结束［图4-31（a）］，发酵醪中杂醇在200mg/L YAN的添加条件下，处于最低值，相对于对照组降低了45.87%。其中异丁醇降低40.10%，异戊醇降低52.49%，β-苯乙醇降低47.15%。降低杂醇趋势明显，但是随着NH₄Cl的添加，杂醇呈现回升趋势。这与宫英振的研究相近，随着氮源添加量的增加有减少的趋势，但是添加到一定量以后，高级醇的生成量不再减少反而又有增加的趋势。在此条件下杂醇的变化可能是由于随着氮源的添加，产杂醇的基因得到表达。

经NH₄Cl处理后酵结束［图4-31（b）］，随着氮源的添加，杂醇的降低趋势呈现阶梯式，在0～100mg/L YAN、100～200mg/L YAN、300～400mg/L YAN分别处于一个水平，这说明在氮源添加的过程中，杂醇的降低存在一个限度。发酵液中杂醇在400mg/L YAN的添加条件下最低。此时实验组杂醇相对对照组降低了36.88%。发酵结束时异丁醇降低38.44%，异戊醇降低41.94%，β-苯乙醇降低34.83%。综上所述，针对黄酒酵母Y1739的最佳添加策略是前酵加入NH₄Cl 400mg/L YAN，能使杂醇降低36.88%。

②在Y1615发酵体系中可同化氮素添加量优化

对黄酒酵母Y1615进行氮源添加优化，实验发现不同氮源种类和浓度添加下，发酵结束时发酵液理化指标均处于正常范围（表4-7）。但在（NH₄）₂HPO₄处理条件下，发酵液中还原糖高于NH₄Cl处理组。与之对应的结果是NH₄Cl处理组乙醇含量相对较高。而随着（NH₄）₂HPO₄的增加，乙醇表现出增加趋势。在不同处理条件下，发酵液总酸含量均随着氮源的添加呈现出增加的趋势，NH₄Cl处理组中总酸相对偏低，且发酵液pH随氮源浓度的增加呈现出降低的趋势，说明高浓度氮源的添加可能会导致发酵液pH的变化，进而影响发酵体系。除此之外，不同处理组之间理化指标无显著差异。

实验结果表明［图4-32（a）］，经（NH₄）₂HPO₄处理后，黄酒酵母Y1615在发酵过程中杂醇产量明显降低。前酵结束之后，实验组杂醇随氮源浓度的增加而减少。其中，对照组杂醇总量为280.12mg/L，杂醇总量最低组别为300mg/L YAN，最低含量为147.38mg/L。其中在300mg/L YAN处理条件下，异丙醇含量为29.39mg/L、异丁醇15.11mg/L、异戊醇54.01mg/L、戊醇0.05mg/L、β-苯乙醇44.91mg/L。相对于对照组，其中异丙醇含量增加了约2倍，而异丁醇降低42.79%、异戊醇降低46.10%、戊醇降低56.87%、β-苯乙醇降低62.71%。后酵结束时［图4-32（b）］，杂醇总量仍延续降低趋势。其中300mg/L YAN条件下，总杂醇含量为161.56mg/L，对照组总杂醇为257.43mg/L，相对降低杂醇37.24%。在300mg/L YAN处理条件下，异丙醇24.09mg/L、异丁醇13.87mg/L、异戊醇51.32mg/L、戊醇0.087mg/L、β-苯乙醇72.20mg/L。除异丙醇外，其他杂醇相对于对照组分别降低61.31%、40.80%、17.09%、46.42%。之所以降低程度和前酵有所差别，可能原因一方面是发酵过程中被黄酒酵母自身代谢分解，另一方面是在发酵过程中受理化反应的影响。

经不同NH₄Cl处理后，杂醇的降低趋势与（NH₄）₂HPO₄处理有着类似的结果，前酵结束［图4-33（a）］，对照组总杂醇含量为280.12mg/L，在300mg/L YAN处理条件下，总杂醇含量为138.93mg/L，降低幅度明显。此时各杂醇含量为异丙醇19.62mg/L、异丁醇17.65mg/L、异戊醇43.53mg/L、戊醇0.084mg/L、β-苯乙醇49.70mg/L。而后酵结束［图4-33（b）］，对照组总杂醇含量为257.43mg/L，实验组400mg/L YAN处理条件下杂醇含量为116.24mg/L，相对降低54.85%。但是此时发酵液pH为3.44，较低的pH可能会影响总体发酵水平。而在后酵过程中，200mg/L处理条件下，总杂醇含量为160.81mg/L，总杂醇相对降低37.53%。300mg/L YAN处理条件下，总杂醇含量为154.49mg/L，总杂醇相对降低39.99%，且200mg/L YAN与300mg/L YAN二者无显著性差异。

综上所述，在（NH₄）₂HPO₄ 300mg/L YAN浓度处理下，总杂醇降低37.24%。而在NH₄Cl 200mg/L YAN处理浓度下，杂醇降低36.70%。但考虑到整个发酵体系pH、乙醇含量、氮源用量等因素，故选取NH₄Cl 200mg/L YAN为下一步实验条件。

③在Y1701发酵体系中可同化氮素添加量优化

在实验条件下（表4-8），对Y1701分别进行磷酸氢二铵和氯化铵的添加，发酵液中的乙醇含量有所上升，均在300mg/L YAN条件下，乙醇含量达到最高。但是，在磷酸氢二铵的添加条件下，乙醇含量要高于氯化铵的乙醇含量（分别为17.78%vol和17.44%vol）。说明这两种铵盐的添加有利于黄酒酵母Y1701的发酵。此外在氮源条件下，发酵液中的总酸有降低趋势。还原糖、pH以及酵母数量无显著变化。

经（NH₄）₂HPO₄处理Y1701发酵，前酵结束［图4-34（a）］，随着（NH₄）₂HPO₄浓度的增加，总杂醇含量呈现降低趋势，在300mg/L YAN条件下杂醇总量达到最低值。前酵结束，对照组杂醇总量为308.48mg/L，在最低处杂醇总量为191.95mg/L，相对降低杂醇37.77%。此时异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇分别降低58.51%、33.88%、38.33%，异丙醇增加26.06%。

后酵结束［图4-34（b）］，不同组的杂醇总量相对于前酵分别降低29.43%、18.75%、19.22%、31.26%、29.47%，降低率最大处为300mg/L YAN。而300mg/L YAN处杂醇总量相对于对照组降低39.38%。此时3种主要杂醇异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇相对于对照组分别降低66.60%、36.95%、39.89%。

NH₄Cl处理实验结果表明，前酵结束［图4-35（a）］，杂醇总量随氮源浓度的增加而呈现降低趋势，在200～300mg/L YAN条件下杂醇含量降低趋势趋于平缓，而进一步加大氮源的浓度，杂醇则进一步降低。相对于对照组在200mg/L YAN处杂醇总量降低34.41%，在400mg/L YAN处杂醇降低44.43%。400mg/L YAN处对于异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇杂醇分别降低48.16%、41.34%、45.77%。

后酵结束［图4-35（b）］，杂醇变化趋势与前酵有所差别，但是整体的趋势没有明显的变化。在400mg/L YAN氮源条件下，杂醇总量为138.81mg/L YAN，相对于对照组杂醇降低36.23%，且与300mg/L YAN处理条件下无显著差异（p<0.05）。在300mg/L YAN处理条件下异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇分别降低38.02%、30.54%、37.11%。综合分析可知，在（NH₄）₂HPO₄ 300mg/L YAN处理浓度下，总杂醇降低39.73%，选定该条件作为下一步实验依据。

通过对两种氮源（磷酸氢二铵、氯化铵）的添加量优化可知，不同黄酒酵母在氮源的添加处理下，杂醇的变化不一。对于酵母Y1739优化可知，降低杂醇最佳添加策略是在前酵时加入NH₄Cl 400mg/L YAN，能使杂醇降低36.88%。对于酵母Y1615优化可知，降低杂醇最佳添加策略是在前酵时加入NH₄Cl 200mg/L YAN，能使杂醇降低36.70%。对于酵母Y1701优化可知，降低杂醇的最佳添加策略是前酵时加入（NH₄）₂HPO₄ 300mg/L YAN，总杂醇降低39.73%。