第二节 他克莫司治疗药物监测
他克莫司（FK-506）是一种大环内酯类新型强效免疫抑制剂，其作用机制与CsA相似。与CsA相比，FK-506具有免疫抑制强度大、肝肾毒性小和无牙龈增生副作用等方面的优势。肾移植受者FK-506给药剂量个体差异大，最大剂量是最小剂量的3倍，浓度不达标易出现排斥反应，浓度超标易发生急性肾损伤、高血糖和外周神经毒性等不良反应。此外，FK-506治疗窗窄，肾移植受者需定期进行 TDM，以期实现 FK-506个体化给药。
【药代动力学】
FK-506是一种难溶于水的药物，不易通过胃肠道吸收。常水溶性多聚物（羟丙基甲基纤维素）制成固体扩散剂，口服生物利用度个体差异大（5%～67%，平均20%），大多数患者口服后3天内可以达到血药浓度的稳定状态。空腹给药达峰时间为1小时，进食可以影响该药的吸收，脂肪食物能够降低该药的吸收速度和数量。进食时给药达峰时间为3小时。空腹给药的最高平均血药浓度几乎是进食时给药的2倍。胆汁不影响该药的吸收。FK-506是高度脂溶性物质，在组织中广泛分布。在血中绝大部分分布于红细胞，可达75%～80%。FK-506在体内主要通过肝脏的细胞色素酶P450酶代谢，在12、13、15及31位发生去甲基化和羟基化，产生9种代谢产物，大部分代谢产物没有药物活性，仅有一种具有药物活性。
【TDM事宜】
1.样本要求
EDTA-K2抗凝全血1～2ml。
2.TDM时机及频率
（1）监测时机：
根据肾移植受者术后时间和病情制订TDM时机。①肾移植术后FK-506首次TDM应在口服给药3天后（浓度达稳态），静脉给药1次后即可；②短期内（一般指术后住院期间）隔天监测，直至达目标浓度，必要时每天监测；③在更改FK-506剂量和剂型、合并使用可或潜在影响FK-506浓度的药物，应在3天后或随时监测；④肾功能下降（FK-506毒性或排斥反应所致）和疑似FK-506导致的其他严重不良反应（如腹泻、头痛/血压升高和高血糖等）时，应随时监测。
（2）监测频率：
肾移植术后1个月每周2～3次；术后2个月每周1～2次；术后3个月应每2周1～2次；术后4～6个月每3周1～2次，术后6～12个月每月1～2次；术后1～2年以上每季度1～3次；术后3年以上每年1～4次。任何原因导致的FK-506血药浓度异常波动时，应增加FK-506的TDM频次。
3.TDM指标
FK-506谷浓度 C0：①FK-506普通剂型，C0为服药12小时后，并于下次服药前0.5小时采样；②FK-506缓释剂型，C0为服药 24小时后，并于下次服药前 0.5小时采样。
如果24小时微泵连续无间断给药，可随时采样，监测体内持续的FK-506稳态血药浓度。
4.治疗窗
肾移植受者最常用的是三联免疫抑制方案FK-506+抗增殖类药物（MPA类药物或咪唑立宾）+糖皮质激素。FK-506目标治疗浓度需个体化（如，联合西罗莫司，其目标浓度应相应的降低；撤销糖皮质激素，其目标浓度应相应的提高）。
器官移植免疫抑制剂临床应用技术规范（2019版）推荐，在FK-506+MPA类药物+激素方案中，FK-506的C0参考范围：术后1个月内8～12ng/ml，1～3个月 6～10ng/ml，3～12个月 4～10ng/ml，1 年以上大于 4～8ng/ml。
不同的移植中心设置的FK-506目标浓度略有差异。比如，上海长海医院器官移植科制订的C0目标：术后1个月内12～15ng/ml，1～3 个月 8～12ng/ml，4～6 个月 6～10ng/ml，7～12 个月6～8ng/ml，1年以上大于5～8ng/ml。此外，对于新生抗供体特异性抗体（de novo special antibody，dnDSA）阳性且肾功能稳定的肾移植受者，建议维持C0大于6ng/ml。
【TDM方法】
目前用于FK-506全血浓度测定的方法主要有免疫法（CMIA、EMIT和 ECLIA）和色谱法（LC/MS），其中 LC/MS主要用于科研。
1.CMIA法
（1）适用仪器：
雅培公司（Abbott）的ARCHITECT系统检测平台，如i1000和i2000仪器等。
（2）检测原理：
混合样本、项目稀释液和FK-506包被的顺磁微粒子形成反应复合物；样本中的FK-506与FK-506抗体包被的微粒子相结合；延迟期过后，将吖啶酯标记的FK-506加入到反应混合中。吖啶酯结合物上的FK-506竞争微粒子结合位点；孵育后，冲洗微粒子，将激发液和预激发液加入到反应混合物中；测量产生的化学发光反应（以相对发光单位RLUs表示），样本中FK-506含量（即浓度）和RLUs值之间成反比（图7-3）。
（3）方法步骤
①缓慢颠倒样本5～10次或轻轻涡旋混匀；
②精密吸取混匀样本200μl至1.5ml离心管中；
③精密吸取200μl FK-506全血萃取试剂；
④强力涡旋混匀15～30s；
⑤离心5min以上，转速10 000g/min以上；
⑥上清液轻轻倒入ARCHITECT移植预处理管中，盖上盖子；
⑦涡旋混匀移植预处理管中的上清液5～10s，须避免产生气泡；
⑧混匀后的移植预处理管转移到样品架上，载入仪器进行检测。
（4）方法特点：
校准范围0～30ng/ml。检测范围2～30ng/ml。检测限2ng/ml。存在交叉反应的FK-506代谢物包括13-O-去甲他克莫司、31-O-去甲他克莫司、15-O-去甲他克莫司和12-羟基他克莫司。
2.EMIT法
（1）适用仪器：
西门子公司（Siemens）EMIT分析平台，Viva-E分析仪。
（2）检测原理：
全血中FK-506与经葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）酶标的酶试剂B中的FK-506竞争结合位点。有活性（未结合）可以将抗体试剂A中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）转化成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），从而造成吸光度的改变。而与抗体结合后，酶的活性会降低，就可以根据酶的活性来确定样本中的FK-506的浓度（图7-4）。
（3）方法步骤
①缓慢颠倒样本5～10次或轻轻涡旋混匀；
②精密吸取混匀样本200μl至1.5ml离心管中；
③精密吸取200μl甲醇（分析醇或色谱醇）加入离心管；
④吸取50μl样本前处理液（硫酸铜溶液）加入离心管，并立即盖上盖子；
⑤将离心管涡旋混匀至少10s（充分混匀）；
⑥将混匀后离心管在室温条件下（18～25℃）静置至少1min，以使反应完全；
⑦在微量离心机中离心至少2min，转速25 000g/min；
⑧将上清液转移至样本杯中，避免气泡产生，载入仪器，开始检测。
（4）方法特点：
校准范围0～30ng/ml。检测范围2～30ng/ml。检测限 2ng/ml。存在交叉反应的 FK-506代谢物包括13-O-去甲他克莫司、31-O-去甲他克莫司、15-O-去甲他克莫司、12-羟基他克莫司、15，31-O-去甲他克莫司、13，31-O-去甲他克莫司、13，15-O-去甲他克莫司。
3.ECLIA法
（1）适用仪器：
罗氏公司（Roche）ECLIA分析平台，Cobase411、601、602分析仪等仪器。
（2）检测原理：
总检测时间18min。第1次孵育（9min）：FK-506特异性生物素化抗体和钌络合物标记的FK-506衍生物与35μl预处理样本一起孵育。免疫复合物形成的过程中，标记的抗体空白结合位点一部分被分析物FK-506占据，一部分被钌标记的半抗原占据。第2次孵育（9min）：添加包被链霉亲和素涂层的磁珠微粒后，该复合物通过生物素和链霉素之间的反应结合到微粒上。将反应液吸入测量池中，通过电磁作用将磁珠吸附在电极表面。未与磁珠结合的物质通过ProCell/ProXCell M被去除。电极加以一定的电压，使复合体化学发光，并通过电倍增器测量发光强度。仪器自动通过2点校正的定标曲线计算得到检测结果（图7-5）。
（3）方法步骤
①缓慢颠倒样本5～10次或轻轻涡旋混匀；
②精密吸取混匀样本200μl至1.5ml离心管中；
③精密吸取200μl免疫抑制剂预处理试剂，并立即盖上离心管盖子；
④将离心管涡旋振荡至少10s（充分混匀）；
⑤离心至少5min，转速至少10 000g/min；
⑥将上清液移至特定样品杯中，载入机器进行检测。
（4）方法特点：
校准范围0～40ng/ml。检测范围0.5～40ng/ml。检测限0.5ng/ml。存在交叉反应的FK-506代谢物包括13-O-去甲他克莫司、31-O-去甲他克莫司、15-O-去甲他克莫司和12-羟基他克莫司。
4.LC/MS法
色谱分析方法LC/MS是利用FK-506结构相似物作为内标，建立药物浓度与仪器响应值之间的定量关系。
（1）原理：
LC/MS是利用液相色谱的高分离效能预先将被测样品中FK-506与其他组分分离开，继而再利用质谱的高灵敏度和专一性进行检测，采用内标法定量，绘制标准曲线读出FK-506的浓度。
（2）方法特点：
LC/MS具有专属性、灵敏性、准确性和特异性高等优点，是测定FK-506浓度方法的“金标准”，可同时测定FK-506及其代谢物，具有很强的专属性。但由于仪器昂贵、操作繁杂、难以保养，多用于实验室自建方法（缺乏通用性），一般不适合日常常规TDM，但适用于科学研究。