五、丝胶蛋白在关节软骨修复中的应用

（一）关节软骨概述

关节软骨（articular cartilage）为关节表面的薄层透明软骨，其表面光滑且附有滑液，是一种特殊类型的结缔组织，主要由软骨细胞（chondrocytes）和胶原蛋白、蛋白聚糖等细胞外基质组成。独特的结构和组成使其表面具有低摩擦力、高润滑性、减震性和耐磨性的特点，同时可分散和传递运动负荷，减少关节间骨骼摩擦，帮助关节进行润滑、无痛的活动。

（二）关节软骨损伤及修复

近年来，由于运动创伤人数的增加和人口结构的老龄化，关节软骨和骨关节炎的发病率逐年升高。软骨损伤主要由创伤引起，可形成软骨及软骨下骨的局限性或大范围损伤，并可导致关节炎的发生。一般按软骨损伤的程度可分为：①部分厚度的软骨损伤（partial-thickness articular cartilage defect，PTCD），即缺损深度不超过软骨钙化层；②全层关节软骨缺损（full-thickness cartilage defect，FTCD），即损伤穿透钙化层。临床上软骨损伤一般采用ICRS分级法：0级为正常关节软骨；Ⅰ级为软骨肿胀、软化；Ⅱ级为软骨表面缺损小于软骨全层的50%；Ⅲ级为软骨表面缺损大于软骨全层的50%，但软骨下骨未裸露；Ⅳ级为全层软骨缺损，软骨下骨裸露或缺损。由于关节软骨无血管、淋巴管和神经分布，在创伤发生后，再生能力有限，难以自愈，往往导致患者运动功能的减退或丧失，给患者和家庭带来痛苦和沉重的负担。因此，及时有效地治疗软骨损伤对缓解关节软骨退化、骨赘形成、进行性滑膜增生和提高患者生活质量等方面具有重要意义。

目前关节软骨修复方法主要包括：①全膝关节置换术：该技术要求高，术后并发症多，尤其容易发生感染、神经血管损伤、关节不稳、下肢深静脉血栓等。②关节镜下关节腔冲洗：即清理软骨碎屑，是将不稳定的软骨予以切除，清除各种致炎因子。然而这仅延缓了软骨的进一步损伤，并没有真正对受损软骨组织进行修复。③关节腔注射技术：是指通过在关节腔内注射生物附加物，如透明质酸、血浆、细胞因子等，给予损伤软骨可分化细胞或细胞因子诱导以达到治疗目的。该技术可改善软骨损伤处的生物环境，提升软骨再生能力。但频繁注射、长期注射会影响治疗效果。④微骨折术：是通过手术在软骨损伤的区域打孔，释放有分化能力的骨髓间充质细胞，增强间充质细胞从骨髓到软骨受损部位的迁移，在损伤处形成纤维软骨组织。然而，微骨折术可能会导致中期和长期的软骨下骨改变，出现软骨下骨囊肿和病灶内骨赘。且微骨折术后形成的纤维软骨含有大量的纤维组织，只能在短期内改善患者症状，不能在功能上完全替代透明软骨。此外，微骨折术的修复效果依赖于骨髓间充质细胞、骨髓生长因子的活性，并与患者的年龄密切相关，因此微骨折术对高龄患者的疗效较差。⑤自体移植：是取患者的自体软骨移植于缺损部位，与微骨折术相比，该方法形成的软骨物理功能和生理功能与健康软骨更相近，恢复速度更快。然而自体骨软骨移植易导致取材部位发生病理性损伤、迁延不愈等问题。⑥异体移植：扩展了供体来源，但存在发生感染、免疫排斥反应、费用昂贵及对供体细胞活性要求较高等缺点。⑦自体软骨细胞植入技术：由于患者使用自体软骨细胞，避免了移植异体细胞或异物而出现的免疫排斥反应或病毒感染，使发生并发症的可能性降到最低。然而，自体软骨细胞植入技术还存在以下缺点：①至少需要两次手术；②患者恢复的时间较长；③使用骨膜瓣在软骨损伤处密封植入的细胞，容易导致皮瓣肥大；④植入的软骨细胞在机械性能上与原组织存在差异。

上述各种方法都属于有创性治疗，因此一定程度上增加了手术风险，延长了患者术后恢复时间，同时也面临供体短缺、易引起免疫排斥反应、易形成纤维软骨等问题，治疗效果有限。近年来，随着组织工程与再生医学的快速发展，人们对于关节软骨修复的研究取得了诸多进展，为关节软骨的成功修复与再生带来了新希望。

（三）软骨组织工程

软骨组织工程的三要素主要包括：种子细胞、生物支架和生长因子。生物支架材料作为人工合成细胞外基质，主要作用是模拟细胞在体内生长的微环境，为种子细胞（软骨细胞、骨膜或软骨膜细胞、骨髓来源基质干细胞、脂肪来源干细胞、脐带来源干细胞等）形成软骨组织提供生长和分化的良好微环境。

理想的软骨组织工程生物支架材料应具有以下特性：①良好的生物相容性：不仅要满足生物医用材料的一般要求，如无毒，无致癌、致畸、致突变等，还要求不引起炎症反应和免疫排斥反应，同时有利于细胞生长和分化；②良好的生物降解性：基质材料应能降解，降解产物对细胞无毒害作用，且降解速率与组织生长速率相适应、达到可控性降解；③合适的结构：应具有多孔的三维立体结构，孔隙率应达90%以上，较高的面积体积比能为细胞的黏附生长、细胞外基质的沉积、营养和氧气的进入及代谢产物的排出等提供有利条件；④可塑性和一定的机械强度：能为新生组织提供一定的力学支撑，并可维持至新生组织自身具备一定机械强度；⑤良好的表面活性：生物材料需提供良好的细胞接触位点，有利于细胞黏附、增殖、分化及迁移。

水凝胶是一种三维交联网状生物材料，具有与天然细胞外基质类似的理化性质，如高含水量、高孔隙率、可生物降解性和生物相容性，是组织工程和再生医学领域中一种十分具有吸引力的生物材料。水凝胶不溶于水，但有明显的溶胀性，交联后形成的网状微孔结构能携带大量水分子，使之拥有类似于活体组织的弹性特征。细胞包埋于这样的微孔结构中既可有效地黏附固定，又可以周围的水为媒介进行细胞间的信号传递。在过去的十多年中，水凝胶类生物材料应用于组织工程软骨的研发已经取得了较多进展。

迄今为止，由不同天然或人工合成聚合物及其衍生物构成的各种类型的水凝胶已被用于关节软骨组织的重建，如海藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、透明质酸、明胶、胶原、丝素蛋白、聚乙烯醇（PVA）、聚乙二醇（PEG）。然而，上述软骨生物支架材料仍然具有一些缺陷：天然材料力学性能差，难以在早期提供足够的支撑和保护，来源少，大规模制备困难且批量均一性较差；一些合成聚合物（例如 PEG、PVA）亲水性和表面活性不足，细胞吸附力较弱，降解产物生物相容性差。因此，目前仍亟待进一步研发生物材料用于关节软骨损伤的治疗。

（四）丝胶蛋白在软骨修复中的应用

基于丝胶蛋白的特性和水凝胶在组织工程和创伤修复中的重要应用价值，王琳教授课题组将SerMA丝胶水凝胶作为细胞外基质应用于软骨的微创修复。

该SerMA丝胶水凝胶具有适用于软骨修复的多种优势，主要包括：①荧光特性，甲基丙烯基修饰的丝胶蛋白（SerMA）具有良好的荧光特性，其发射光谱位于两个荧光波长范围（300～520nm和540～800nm）之间。SerMA丝胶水凝胶的荧光强度高，注射到小鼠体内可示踪，实时监测水凝胶的位置和动态降解过程。②良好的生物相容性，可支持软骨细胞在其上长期存活，并不会激活巨噬细胞（RAW 264.7）产生炎症反应，生物相容性良好。③细胞黏附性和促细胞增殖能力，可促进软骨细胞的有效黏附和增殖。④促软骨修复的生物学特性，在SerMA丝胶水凝胶上生长的软骨细胞可分泌Ⅱ型胶原蛋白和糖胺多糖（glycosaminoglycan，GAG），且高表达Ⅱ型胶原蛋白 a、聚蛋白多糖（aggrecan）以及SOX9（SRY-related High mobility group-box gene 9）等软骨分化的关键基因。⑤可采用光交联，无需使用化学交联剂。⑥可通过改变甲基丙烯酰基修饰程度，精确调整水凝胶的机械性能及降解速率、“按需”优化，以满足不同类型软骨的个性化修复需求。

将SerMA溶液与软骨细胞混匀，通过皮下注射植入裸鼠背部，再通过紫外交联形成类软骨基质结构。8～12周后，体内植入的SerMA丝胶水凝胶成功地产生了具有三维结构的人造软骨（图10-8）。其中软骨细胞不仅能在SerMA丝胶水凝胶中长期存活增殖，还能产生软骨特异性细胞外基质。这种人工制备的软骨具有与原生软骨相似的结构及功能特性，因此适用于软骨的创伤修复。

图10-8　丝胶水凝胶合成及动物实验流程图

王琳教授课题组研究证明，这种光交联的Ser-MA丝胶水凝胶具有良好的生物相容性、能有效促进软骨细胞增殖、上调软骨形成相关基因表达以及促进软骨细胞外基质的沉积，并能形成具有功能性的软骨组织。此外，SerMA丝胶水凝胶可通过微创注射的方式应用于关节创伤处，与临床常用的有创性治疗相比，可减轻患者的痛苦，因此在软骨的创伤修复方面具有良好的应用前景。