三、静电纺丝与组织工程

（一）静电纺丝应用于组织工程的优势

设计出能模拟细胞外基质（ECM）的材料一直是人造生物材料设计领域的研究热点。利用细胞外基质的独特几何特征，包括其三维结构和网状纤维形态，可以支持给定的细胞表型，定向细胞迁移，并操纵细胞空间行为。电纺丝可以很容易地形成高孔隙的、相互连接的纤维基质，用来模拟ECM的自然纤维形态结构，作为有效地支持细胞的强大模板，有效地传递细胞，并可使多种组织再生。

近年来，人们越来越关注利用这种技术生产纳米纤维，特别是制备由各种天然和合成聚合物组成的用于组织工程的纳米纤维支架，如聚乳酸、聚氨酯、丝素蛋白、胶原蛋白、透明质酸、纤维素、壳聚糖/胶原蛋白。尽管静电纺丝具有几个优点，但纳米纤维的生产量一直是一个严重的瓶颈问题，限制了它们的应用。为了提高这些纺丝纤维的生产速率，多个研究小组已对采用两层静电纺丝系统，下层为铁磁悬浮液，上层为聚合物溶液，多个喷丝板或喷嘴系统排列成线/圆/矩形以及新的底部喷气静电纺丝（气泡静电纺丝）进行了研究。在各种应用中都需要使用大量的纤维，而通过单喷射来放大纳米纤维并不是非常可行的方案。各研究小组使用多孔空心管以获得多个射流，在这种情况下，通过增加管的长度和孔数可以提高生产率。

（二）静电纺丝结合生长因子在组织工程中的应用

1.静电纺丝在皮肤修复中的应用

皮肤在受到外界刺激损伤下，如创伤、手术及烧伤等急慢性损伤以后会在皮肤表面形成伤口，此时皮肤损伤易引起新陈代谢紊乱、水分和各种营养物质消耗过快，从而导致免疫力低下，如不及时治疗可能引起其他并发症，严重者甚至可能危及生命。皮肤愈合是一个复杂缓慢的过程（图13-3），因此，在受损之后尽快修复皮肤创面非常重要。传统医用敷料的材质主要是脱脂棉纱布、纱布条、棉球和棉膜等天然纤维性材料，可以干燥伤口，具备物理隔离功能。虽然传统敷料制作简单、价格便宜，但是传统敷料与渗出物结痂后易造成伤口粘连，在进行换药时可引起新的创伤，且伴随疼痛，同时有易引起细菌滋生、止血性能不佳等不良反应。设计的新型敷料应满足以下要求：生物相容性好，不会对人体产生刺激、中毒和病变等不良反应；具有保湿、稀释的作用，在有效保留渗出液的同时不积液；不易与伤口渗出物粘连，尽量减少对新生组织的损伤，换药时疼痛感轻；具有预防伤口感染的作用。

能促进伤口愈合的生长因子也很多，可以由实验室菌类、植物精华等天然物质提取而来，与人体自身所分泌的生长因子完全一致，可以安全用于人体，并无毒副作用和依赖性；有的生长因子还可以直接到达细胞核，对基因起到修复作用，促进细胞分裂、繁殖、获得新生，使疾病从根本上得到有效的治疗，同时提升机体的各项功能，并且可以使容颜得到美化；在皮肤愈合过程中，参与的生长因子繁多，通常情况下多为广义的肽激素，包括 FGF、EGF、胰岛素、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）以及生长激素释放抑制因子（somatostatin，SRIH）等，其中碱性成纤维细胞生长因子bFGF在巨噬细胞、平滑肌细胞以及内皮细胞中都有所分泌。在皮肤愈合中，给予外源性的bFGF能够促进细胞增殖、分化和成熟，在伤口愈合中起到至关重要的作用。适量的bFGF在伤口修复的过程中能够对肉芽组织产生一定的作用，刺激皮肤肉芽组织生成与上皮化。bFGF还可以通过调节胶原的降解、更新，达到减少瘢痕形成的目的。成纤维细胞生长因子（FGF）及其受体（FGFR）被认为是胚胎发育和组织修复的必要条件。

静电纺丝所具备的多功能性使其流行的速度日益加快，目前，静电纺丝技术在生物医学、环境工程和能量的收集与储存方面的应用成为研究的重点，其比表面积大、载药量大，且所得的纤维纺丝与很多细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中的胶原纳米纤维结构非常相似，在组织工程如皮肤创面修复中也起到至关重要的作用。目前有研究者也将很多常见材料用于电纺应用与皮肤修复，如胶原、藻酸盐类等。胶原没有固定的机械性能，虽然其抗原性低、可降解，但是也容易被细菌污染变质，在渗出和感染性伤口创面中应用欠佳。同样，藻酸盐等虽然具有良好的防水性、止血功能，但是容易干燥结痂，在创面应用中也有很多缺点。而有研究将降解高分子聚合物PLGA作为载体，以其担载姜黄素和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）应用于创面模型，而PLGA本身具有可降解性、生物相容性好，并具有一定的支撑作用，而姜黄素具有一定的抗炎作用。三者搭配对创面愈合起到一定的促进作用。三者本身并不具有化学键的结合，而将材料和生长因子、姜黄素等一起混纺，则能够将药物包载在纺丝内部，能够起到一定的控释作用并能够增加稳定性。该静电纺丝纤维膜敷料本身对正常细胞没有毒害作用，且相较于对照组，该纤维膜能够明显缓解炎症的发生，促进肉芽组织爬行和皮肤的修复。另外，促进伤口愈合的方式有很多种，包括促进肉芽组织爬行、促进胶原形成或者直接对表皮爬行具有促进作用，而EGF是一种单链多肽生长因子，对表皮有明显的促进生长的作用。EGF属于由13个配体组成的EGF家族的一员，其生物学功能是通过其位于细胞表面的4种跨膜的酪氨酸激酶受体（ERBB）来完成的。皮肤创伤修复中，EGF能够特异性识别整个表皮层尤其基底层的受体，并与之结合，通过激活几个相关信号通路来促进表皮细胞的生长，加速上表皮的重建。而有研究表明利用氨基的化学反应，EGF被共价交联到静电纺丝PCL纳米纤维的表面。在体动物实验表明，移植共价交联EGF的纳米纤维支架与直接注射EGF溶液相比，前者能够显著地加快创伤的愈合。而PCL在组织工程中最为常见，与PLGA相似，具有良好的生物相容性和可降解性，结合透明质酸HA，还可以有效克服PCL的疏水作用。皮肤创伤修复的很多重要的生物学过程，如炎症反应、新生组织的生成、表皮组织的生成以及组织重塑等都要受到HA的调节。且HA可以通过受CD44调节的信号通路来促进肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）和白介素-8（Interleukin-8，IL-8）的表达，而且表达的升高量与HA的浓度呈正相关，在皮肤创伤修复中细胞的迁移对于新生组织的生成起着极其重要的作用。HA还可以通过其在细胞表面的信号受体，如CD44（透明质酸受体）、细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、细胞游走受体（receptor for HA-mediated motility，RHAMM）等调节细胞的运动机制来促进细胞迁移。将PCL、HA以及EGF混合之后作为皮肤创面敷料应用于急性创面模型中，各种成分能够发挥优势，对皮肤的愈合起到明显的促进作用，能够明显促进表皮的爬行和恢复。但是EGF主要的特点在于促进表皮的爬行，对新生血管的作用并不是特别明显。也有研究将VEGF代替EGF作为敷料应用于创面模型，发现对皮肤的愈合也起到至关重要的作用，尤其是能够促进新生血管的形成。在以后的急性创面中，多因子载入静电纺丝纤维膜也具有良好的应用前景。

EGF不仅在进行性创面中有一定的疗效，在慢性创面愈合中也起到一定的作用。慢性伤口形成后，炎性细胞不断涌入伤口，细胞基质中有大量炎性细胞因子，致使创面长期处于一种慢性炎症状态，伤口愈合的过程被打断，不能及时正常地进行。慢性伤口的表面抑制巨噬细胞活性的转化生长因子β1的水平降低，造成巨噬细胞的活性增高。高活性的巨噬细胞会分泌大量的单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1），这将吸引更多的巨噬细胞进入伤口表面。大量的巨噬细胞会分泌大量的炎性细胞因子，这些炎性细胞因子会诱发高水平的基质金属蛋白酶。高水平的基质金属蛋白酶会阻碍细胞外基质的形成，并破坏伤口愈合过程中必不可少的生长因子（包括血管内皮生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等）、受体以及基质蛋白，阻碍肉芽组织的形成，从而抑制上皮的形成，使伤口不能正常愈合。而在伤口表面持续补充生长因子，如bFGF、EGF等，可明显加快伤口愈合的速度，为患者减轻痛苦的同时促进整个创面的修复。如有研究PLA与包载EGF蛋白的壳聚糖纳米颗粒结合的纳米纤维敷料，具有良好的缓释作用，将其作为创面辅料应用于慢性皮肤创面，起到加速创面愈合的良好作用。

各种仿生材料都有各自的优缺点，胶原、聚己内酯（PCL）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）、聚乙烯醇（PVA）、丙交酯-己内酯共聚物[poly（L-Lactide-co-caprolactone），PLCL]、透明质酸（HA）等都是非常好的源头材料。克服各自的缺点，可进行各种材料的混合弥补，然后进行药物的载入，都在组织工程中起到一定的作用。容易染菌的药物，可以混入Ag等离子克服缺点，还可以起到一定的抗菌效应。而机械性能不好的胶原等可以混入具有一定机械性能强度的PLGA、PCL克服缺点，同时还能够解决PCL疏水的缺点，两者结合，各自发挥优势，而在生长因子的载入方面，也是多样化的，在以后的研究中，发挥药物之间的协同作用，是非常好的研究方向。

2.静电纺丝结合生长因子在血管组织工程中的应用

血管组织工程指利用血管壁的正常细胞和生物可降解材料来再生血管的科学。组织工程血管化一般需要三个重要元素：组织工程支架、血管生成细胞和细胞因子。静电纺丝纤维具有高孔隙率，增加了细胞与纤维的接触面积，更有利于细胞的黏附，成为组织再生中较成熟的方法。

血管内皮生长因子（VEGF）又称血管通透因子（vascular permeability factor，VPF），是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。血管内皮生长因子有5种不同的亚型，根据氨基酸的数目命名为VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206，其中VEGF165为VEGF的主要存在形式。VEGF能够促进低氧环境下血管的增生，通过提高血浆酶原活化因子（plasminogen activator，PA）和血浆酶原活化因子抑制因子-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）的信使RNA表达，来提高血浆酶原活化因子的活性，促进细胞外蛋白水解，进而促进新生毛细血管的形成。同时VEGF可以诱导血浆蛋白溶酶原激活物、血浆溶酶原激活物抑制剂-1、基质胶原酶以及组织因子等在内皮细胞的表达，激发V3因子从内皮细胞中释放出来，从而改变细胞外基质，使其更易于血管生长。VEGF为内皮细胞分裂促进剂，它介导着内皮细胞发生迁移及增殖，会导致血管通透性增加，从而加速基底膜降解，继而构建新生血管。在血管组织工程中，静电纺丝血管是非常优秀的生物支架，主要原因是其具有强大的机械性能、良好的生物降解性等，同时比表面积大，可以进行大量载药，且血管壁牢固，不易导致血管内部血液或者细胞基质的外漏。有研究者将VEGF直接包载入材料中进行静电纺丝，但是也很容易造成局部作用药物浓度过大等问题，容易对组织细胞产生一定的影响，将VEGF水溶液通过水包油（W/O）乳液法制备成有效释放VEGF的静电纺丝纤维管可以有效解决该问题，能够使药物的释放更加稳定。此法水包油静电纺丝并不会影响VEGF在体外的生物活性，得到的纺丝能够促进内皮细胞的生长爬行，而内皮细胞是构成血管的基本组分之一，目前大部分采用细胞来促进组织工程皮肤血管化的方法，都直接或间接地使用了能够应用于血管再生和血管化形成的内皮细胞结合三维支架。

主要涉及的仿生材料也是最为传统的聚己内酯（PCL）材料，而有实验也证明了PCL的力学性能和柔韧性是无可比拟的，在体内的降解时间大致为1年，可作为良好的血管支架材料，相较于其他材料，如聚乙醇酸（PGA）与聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）的相对硬度较大、降解过快，PCL柔韧性更好、降解缓慢且利于细胞的增殖，更适合作为支架材料。也有研究发现，将聚左旋乳酸（PLLA）和聚己内酯（PCL）按70∶30比例（质量比，下同）共混电纺，制备的多孔膜支架与猪冠状动脉平滑肌细胞复合培养105天，观察到该支架能长时间支持血管平滑肌细胞生长和增殖，且维持细胞表型，有望成为理想的血管支架材料。也有利用PLLA和PCL （70∶30）电纺制备了直径 3mm、壁厚 100μm的管状支架，该支架抗张强度为7MPa，远远超过腹主动脉（1.47MPa），植入兔腹壁浅静脉7周后，支架仍保持通畅且结构完整。此外，还有研究将静电纺丝血管纤维纺织成三层结构，每层还可以混入不同的药物增加血管化进程，如采用PCL、弹性蛋白（elastin，ELAS）、胶原蛋白（collagen，Col）按不同配比共混的电纺，顺利构建了三层血管支架，这就意味着每层的纺丝层都起到不同的作用，可进行多层载药，同时增加了纺丝机械性能，满足血管所必需的内皮压力、爆破值，利于血管正常的工作，不会出现移植部位纤维血管崩塌等现象。总而言之，多层血管支架能更好地模拟天然血管的形态结构与力学性能，将成为电纺制备小直径血管支架的趋势。

可见静电纺丝本身非常适用于血管，也具备完善的技术。另外，在血管中加入适当肝素可以起到抗凝血的作用（见图13-3），加入生长因子，如PDGF、VEGF等能够促进内皮细胞的增殖，进而促进血管再生。当然，人体很复杂，要将生长因子和静电纺丝结合再利用到人体还有一段路程要走，移植的纤维血管是否能消除患者的痛苦，以及是否能够减少免疫排斥反应等，都还需要漫长的时间去研究探索。

3.静电纺丝结合生长因子在心脏中的应用

冠心病严重威胁着人类的健康，近年来其患病率急速上升，冠状动脉旁路移植术和经皮冠脉介入治疗已经挽救了大量冠心病患者的生命，但是，对于弥漫性冠脉血管病变、微小血管病变以及二次手术缺乏桥血管等患者，目前国内外均无有效的治疗方式，大量终末期冠心病患者只能期盼难以广泛推广的心脏移植。在激光心肌血运重建术的动物实验中发现，激光打孔过程中释放热量，导致周围组织由内向外形成炭化焦痂层、凝固性坏死层和心肌细胞变性层，并在2周后孔道完全闭塞，其主要原因是在进行组织修复过程中出现纤维化，产生凝血现象，不利于心肌修复。那么基于该问题，研究者发现利用静电纺丝良好的机械弹性，同时加载肝素缓释抗凝形成的支架直通心腔，一方面通过支架的力学特性支撑孔道开放，另一方面通过支架的生物降解特性，缓释肝素持续抑制凝血途径的激活，避免孔道因挤压或血栓而闭塞，有效克服了上述问题。

但是，真正的心肌血流灌注依赖于孔道周围下游血管网络的重建，即只有这些微循环的连接才能将血液分配到缺血的心肌。因此，在保证力学特性的前提下，在支架侧壁产生排列规则的微孔，并通过生物高分子材料复合碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），基于与内皮细胞硫化肝素受体的高度亲和力，启动内皮细胞合成基质金属蛋白酶，降解基底膜屏障，并释放扩张血管，诱导内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、巨噬细胞向管腔侧壁发芽、迁移，促进下游血管网络及侧支血管的重建，从而改善周围缺血心肌的灌注。另外，研究者将bFGF复合肝素化聚己内酯（PCL）/聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）支架移植入小型猪心肌，后期在组织切片染色中发现材料的加入能够减少心肌壁的纤维化，减少周围心肌炎性细胞的浸润，同时肝素的加入具有明显的抗凝血作用，减少血块的形成，能够保持透壁性孔道的长期开放，使心腔内血流能够通过灌注周围缺血组织，促进心肌功能的恢复，进而改善整体心脏功能，同时能促进血管的形成，促进心肌壁缺损的修复。而bFGF载入静电纺丝中，能够有效延长其作用，但依旧作用时间有限，在前期能够有效诱导细胞迁移、其他细胞因子的分泌。碱性成纤维细胞生长因子与肝素的结合，能够有效地改善心脏的功能。

4.静电纺丝复合生长因子应用于牙周组织缺损的修复

在口腔医学领域，牙周病、根尖病变、创伤等原因造成牙周组织的缺损，拔牙后剩余牙槽嵴的吸收，以及在种植义齿修复时骨量不足等原因均会造成牙齿支撑组织缺损。目前这些问题主要通过能够在缺损部位增加骨量或改善骨质量的引导组织再生术，或引导骨组织再生术来进行治疗。其中引导组织再生术（guided tissue regeneration，GTR）可用于牙周组织的缺损修复，此方法将一种屏障材料置于牙根和牙龈瓣之间，阻挡牙龈结缔组织细胞和上皮细胞与牙根先接触，保证牙周膜组织来源细胞和牙槽骨细胞优先占据牙根面而生长，使组织修复再生能力得到最大限度的发挥。而静电纺丝是制备超细纤维的一种重要方法，得到的电纺纤维具有直径小（几纳米至几微米）、比表面积高等特点，经过调节参数，形成一定厚度的超细纤维膜，放置在牙根面与牙龈瓣之间的生物屏障间，以诱导牙周组织的再生，这也是牙周引导组织再生的核心所在。

研究者将重组人骨形态发生蛋白2（Recombinant Human bone morphogenetic protein-2，rhBMP2）生长因子作为治疗药物，rhBMP2是一种骨形态形成蛋白生长因子，是一类小分子蛋白，在血液和组织中含量微小，具有多种调节功能，在组织修复过程中调节细胞的增殖、趋化、分化和细胞外基质的生物合成等，能明显促进牙周组织的再生和修复，这种蛋白还能够诱导动物或人体间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织。但是这种蛋白也存在和其他生长因子一样的弊端，就是在体内容易被酶类降解失去作用，所以目前针对rhBMP2生长因子的治疗逐渐转向基因治疗，比如基因转移、基因转染等。将rhBMP2载入具有纳米结构的静电纺丝纤维中，能够有效降低rhBMP2的降解速率，并能够保持一定的稳定性和生物活性。羧甲基壳聚糖为应用于牙周组织的常见材料，其具有一定的降解性可有效满足牙周组织的修复过程，同时具有杀菌消炎作用，可以引导牙周组织再生重建，也不必要二次手术取出。但因其具有水溶性，机械性能较差，故需加入羟基磷灰石混合进行电纺。因为羟基磷灰石本身也是人体自然骨的主要成分，能够提高膜的力学性能和拉伸强度。而rhBMP2事先通过微球对其进行包载，保护其活性，再对其进行混合电纺丝，能够进一步增加rhBMP2的稳定性，而在一定的电压下，并不会破坏微球本身的结构，自然不会破坏rhBMP2的生物活性。另外，Susan Liao等研究者制备的胶原/透明质酸/PLGA膜，具有三层梯度复合结构，其最外层为PLGA无孔膜材料，中间为复合过渡层，内层为胶原的多孔膜材料。这种复合膜材料不仅能综合胶原的生物相容性、骨引导性和力学性能等优势，有效避免了降解过程中引起的无菌炎症反应，还能够充分发挥引导组织再生的功能。这种材料复合和结构化的概念在其他生物材料里也同样得到了应用。

5.静电纺丝在软骨损伤修复中的应用

因创伤、炎症、肿瘤等导致的软骨损伤在临床上较为常见，且涉及软骨损伤性疾病的患病率还会因为我国人口老龄化问题的加剧而进一步升高，从而严重影响人们的生活质量并增加社会负担。软骨因为自身的结构和功能特点，导致其受损后再生能力很差，因此这类患者常常需要接受各类保守治疗或手术治疗，甚至无法治疗而终身残疾。但是传统的治疗方法都存在着不可忽略的缺点，如组织移植术中的自体移植需要开辟第二术区，造成二次创伤，异体移植会引起免疫排斥反应，且供体来源受限；骨髓刺激术所修复的组织性能较正常软骨组织差，且远期效果不佳。而在软骨损伤治疗中常见的组织工程是不错的方法，常见的组织工程必须包含三大因素：种子细胞、生物支架、生物因子，常采用相关工艺制备成具有特定形状、结构和性能的组织工程支架，再将一定数量的种子细胞接种到支架上，在生物因子的程序性刺激下，细胞按照预定的程序合成分泌相应的细胞外基质，并以生物支架为模板组装成特定的结构，同时生物支架逐渐降解，为新生组织提供空间，从而最终修复受损组织和器官。

在软骨组织工程中，常用的支架材料主要有天然高分子材料、合成高分子材料等。每一种材料都有其优点和缺点，没有一种单一的材料能够同时具备其作为组织工程支架的所有性能。常用的天然高分子材料主要有胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖、脱细胞软骨基质、丝素蛋白（silk fibroin，SF）等。天然高分子材料通常具有良好的生物相容性、亲水性、生物降解性，其降解产物可以完全被机体吸收，因此被广泛应用于软骨组织工程中。而常用的合成高分子材料主要有 PLA、PGA、PCL、PEG、聚羟基丁酸酯（polyhydroxybutyrate，PHB）等，其中 PGA、PLA、PCL已获得美国 FDA批准应用于临床。已有研究者将聚乳酸（PLA）进行改造得到左旋聚乳酸（PLLA），然后与丝素蛋白复合进行静电纺丝，之后接入原代软骨细胞和生长因子进行培养，发现原代软骨细胞能够正常生长，同时能够防止软骨细胞的去分化作用，使软骨细胞维持正常形态，分泌软骨特异性的ECM，具有较好的成软骨效果，为软骨损伤修复提供了良好的基础。当然，除此之外，胶原、透明质酸钠和硫酸软骨素属于软骨细胞外基质，同时也是一种优异的生物材料，具有良好的组织相容性。同时利用这三种原料构建组织工程软骨支架，一方面这样的支架包含软骨细胞表面受体的特异识别位点，可以很好地保存软骨细胞而不流失，且抗原性较弱，不易引起排斥反应，具有良好的组织相容性；另一方面这些基质构建的支架可以较好地模拟软骨细胞生长的微环境，有利于细胞在支架上的黏附、生长和分裂增殖，还能进一步将合成的天然细胞外基质作为支架使细胞聚集而构建组织，控制组织结构并调控细胞表型，在软骨组织损伤中能够明显促进修复，为以后软骨组织修复提供有力的基础。