第三节　线粒体与氧化应激

线粒体（mitochondria）通过氧化磷酸化（OSPHOS）和电子呼吸链产生三磷酸腺苷（ATP），是细胞能量产生中枢，在保障机体正常功能中起着至关重要的作用。研究认为，线粒体是机体和细胞衰老过程中的重要元件。

线粒体有4个主要功能：①产生ATP；②产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）；③启动细胞凋亡途径；④钙离子波动。随年龄增长而老化的线粒体主要通过这4种功能异常导致卵巢功能的衰退（图3-3）。

图3-3　线粒体结构及功能示意图

多项研究表明，衰老动物的各组织中线粒体数目减少，卵巢也不例外。通过对不同年龄组人卵泡超微结构观察发现，高龄组卵母细胞的线粒体数量较年轻组少。对啮齿类动物卵母细胞的研究也同样发现了线粒体数目随着衰老过程减少的现象。线粒体内具有一套独立于核基因的遗传系统，称之为线粒体DNA（mt DNA）。每一个线粒体通常含1~2 套mtDNA，线粒体数目的减少与mtDNA数量的变化息息相关。为了评价细胞内线粒体数目，研究中常通过mtDNA的拷贝数来反映线粒体数目。mtDNA是一组16 569bp大小、缺少组蛋白的环形DNA，它不同于核基因的孟德尔遗传规律而呈母系遗传。mtDNA主要编码13种蛋白分子，即呼吸链复合体亚基、细胞色素C氧化酶亚基、ATP酶亚基等，另外还包括 22tRNAs、2RNAs，但是几乎不包含任何非编码区和内含子区。每一个成熟卵母细胞中mtDNA拷贝数大约在138 000~640 000，mtDNA 的减少伴随着线粒体数量的减少。

研究表明，在C57BL小鼠卵母细胞中，年老组mtDNA的数量比年轻组少2.7倍，mtDNA数量在300日龄以后明显下降。在人类，有研究者通过比较≤34岁和>38岁IVF患者黄素化颗粒细胞发现，>38岁的IVF患者黄素化颗粒细胞中正常的mtDNA水平明显低于≤34岁的患者。另有研究者对不同年龄段女性卵母细胞mtDNA 进行巢式PCR后发现，mtDNA突变组平均年龄为33.4岁，mtDNA无突变组平均年龄约为30.5岁。PolgA是一种核编码的mtDNA多聚酶亚基，PolgA基因突变小鼠由于缺乏合成 mtDNA多聚酶的这种催化亚基，导致mtDNA突变逐渐累积，从第9个月开始出现早衰的表型，如脱发、骨质疏松等，提示mtDNA突变与哺乳动物衰老表型之间存在因果联系。mtDNA这种缺少组蛋白保护、缺少内含子的结构使得其非常容易接触到ROS等有害代谢产物并发生功能性突变。而mtDNA的修复需要核基因编码的修复酶进入线粒体内发挥作用，虽然mtDNA与核基因共用同一套修复系统，但该修复系统并不十分适合mtDNA，修复机制的不专一性也成为mtDNA突变率高的原因之一。目前已经有150多种 mtDNA 突变或重排形式被发现，然而最常见的莫过于ΔmtDNA 4 977片段缺失，它包含位于第8 470位到12 477位之间的2组13bp的重复片段。Δmt DNA 4 977缺失可干扰ATPase 6、ATPase 8、细胞色素氧化酶Ⅲ及氧化还原酶亚基的合成，造成上述蛋白亚基异常或缺失，进而导致氧化磷酸化功能异常及能量产生障碍，引起细胞功能受损和组织衰老，目前ΔmtDNA 4 977重排突变现象已成为衰老的一个重要标志。已有研究者证实>38岁组的 IVF 患者黄素化颗粒细胞线粒体ΔmtDNA 4 977缺失显著高于≤34岁组，并影响其生育能力，此外，除了Keams-Sayre综合征患者卵母细胞以外，绝经期和绝经后期女性的卵巢组织中也存在ΔmtDNA 4 977缺失，且这一缺失突变在围绝经期累积迅速，其中50岁女性卵巢中缺失mtDNA比例比36岁女性约高100倍。另一种ΔmtDNA 5 286突变也被发现与IVF卵母细胞质量下降有关系，但与年龄、IVF成功率均不相关，表明ΔmtDNA 5 286虽然是机体衰老的检测指标，但还不能作为卵母细胞衰老的一项指标。

随着年龄的增长，不仅细胞内线粒体数量、mtDNA突变率会发生改变，细胞内线粒体的结构也会发生异常。一项对不同年龄组人类卵泡超微结构观察的研究表明，随着年龄增长，卵母细胞线粒体基质密度下降，弥散扩大的滑面内质网增多，颗粒细胞中破溃的线粒体膜和滑面内质网弥散发生频率也升高。有研究者通过电镜观察发现，在年轻的颗粒细胞中线粒体具有完整的管状嵴，在年老的颗粒细胞中线粒体则表现为空泡化，甚至破裂，嵴和基质都发生退行性变化或消失。线粒体体积变大和膜电势的改变与氧化应激的增高相关，上升的氧化应激水平引起了膜电势的改变，最终导致细胞器体积的扩大。这些形态结构特征的改变与线粒体功能的下降相一致，预示着衰老动物中卵母细胞的损伤、核纺锤体活性的降低或染色体的异常分离。

综上可知，线粒体在维持正常的卵巢生理功能中起重要作用，这种作用可能是通过影响ATP合成、钙离子通路和细胞凋亡的过程实现的。首先，线粒体产生ATP 减少会造成细胞功能异常，从而影响卵巢包括激素分泌、卵母细胞成熟及排卵等在内的正常功能。当卵母细胞在减数分裂后期纺锤体形成过程中线粒体ATP供应不足，纺锤体形成受到干扰，将会出现染色体排列异常和非整倍体产生。其次，在有氧代谢的过程中，生成三磷酸腺苷（ATP）和氧化磷酸化的过程不可避免地产生ROS。ROS包括超氧阴离子自由基、羟基自由基和过氧化氢，可以破坏生物分子并危害生物自身调节机制。女性生殖寿命的晚期，卵巢中剩余的卵母细胞在排卵前必定经过了长达几十年的静止期。而这漫长的休眠过程也是ROS逐步积累的过程。ROS可导致mtDNA突变，破坏端粒，使端粒变短。在颗粒细胞和卵巢间质组织中，氧化损伤的脂质、蛋白质和DNA的数量随着年龄的增加呈现明显增加的趋势，而在这个过程中，抗氧化酶的表达也在改变。研究显示，超氧化物歧化酶（SOD）的表达量以及酶的活性都随着年龄的增长而降低。因此，在衰老过程中，不仅ROS随时间积累，同时机体对ROS的抵抗能力也在明显下降。氧化应激被定义为活性氧产生与抗氧化清除作用之间的失衡。对于脊椎动物来说，氧化应激与生殖功能之间存在着密切联系。

活性氧作为氧化应激的主要产物，会导致精子、卵母细胞、胚胎本身及其所处的微环境发生改变。在生殖道中，活性氧发挥着生理和病理两方面的作用，它对于卵母细胞成熟、卵泡产生、维持输卵管功能、子宫内膜周期性改变等过程均很重要。超生理水平的活性氧对生殖系统的各个功能产生一定的负面影响，如卵子的损伤或畸形、子宫内膜异位、流产、宫内生长受限、子痫前期，甚至不孕症。有研究表明，不明原因不孕患者体内的抗氧化剂浓度明显低于具有正常生育功能的女性，反之其腹腔液中的丙二醛（一种脂质过氧化物）的浓度却明显高于生育功能正常的女性。这提示不明原因的不孕患者机体的抗氧化能力明显降低，而氧化应激诱导的脂质过氧化损伤却明显增加。

氧化应激可以通过过度产生活性氧，诱导DNA、蛋白质、脂质及其他一些大分子氧化损伤而诱导凋亡；此过程往往伴随着包括细胞皱缩、染色质凝聚、凋亡小体形成等在内的一些细胞形态学的改变。此外，氧化应激可以通过活性氧介导的线粒体途径诱导颗粒细胞的凋亡，从而影响卵泡发育。凋亡的线粒体途径主要是通过细胞色素C从线粒体释放入细胞质，激活Caspase-9，从而触发了下游的Caspase级联瀑布，最终引起凋亡过程的终极因子Caspase-3的激活。凋亡是决定卵泡命运的重要程序，所谓卵泡闭锁是指卵泡未能被选择成为优势卵泡而通过凋亡途径萎缩，卵泡过度闭锁将导致卵巢功能异常，从而降低女性的生育能力。另外，抗氧化防御机制在维持卵巢周期正常功能方面起着重要作用。与年龄相关的生殖系统抗氧化状态的改变将引起类固醇激素产生紊乱，这也是衰老最终引起不孕的重要原因。作为氧化应激的重要结局之一，一些慢性炎症性疾病也会引起氧化还原反应失衡，从而威胁女性的生殖健康。研究显示，在不孕女性机体中存在着氧化应激诱导的炎症反应，如在糖尿病大鼠模型中，氧化应激对卵巢产生了毁灭性的作用，而应用白藜芦醇可以通过抑制NF-κB途径改善氧化应激对卵巢的负面效应。机体内最重要的抗氧化酶包括超氧物歧化酶（Mn SOD、Cu/Zn SOD）、GPx和过氧化氢酶，其中Mn SOD位于线粒体基质，Cu/Zn SOD位于内膜间隙和细胞质。有研究已证实卵丘细胞内的超氧物歧化酶SOD活性会随着年龄增长而降低，从而减弱了对卵母细胞的保护。

在卵巢衰老的过程中，伴随着氧化应激及抗氧化应激系统失衡导致的氧化应激产物的逐渐累积导致线粒体发生了一系列的变化，包括数量减少、结构异常、mtDNA缺失突变、氧化磷酸化功能减退，以及ROS增多及其氧化损伤反应等，这些变化和衰老卵巢的退行性改变密切相关。已有研究表明通过细胞质移植将年轻卵母细胞的线粒体转入年老卵母细胞能够显著提高老年女性IVF的成功率，说明线粒体对卵母细胞成熟及后续的生殖过程具有重要作用，但涉及的分子机制仍然需要进一步探究。了解线粒体在卵巢衰老过程中的变化有助于阐明其在卵巢衰老过程中所扮演的角色，为将来通过调控与操作线粒体，实现对卵巢衰老的延缓与治疗提供理论基础。