第二节　脱氧核糖核酸提取

脱氧核糖核酸（deoxyribo nucleic acid，DNA）是一种最重要的生命基础分子，可组成遗传指令，引导生物遗传、生物发育与生命功能运作，主要功能是长期性的信息储存，其中带有遗传信息的DNA片段又被称为基因。DNA分子结构中，两条多脱氧核苷酸链围绕一个共同的中心轴盘绕，构成双螺旋结构。

DNA是一种长链聚合物，组成生物界DNA的碱基主要有4种，即腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）。这些碱基沿着DNA长链，形成遗传信息，指导RNA合成，进而指导蛋白质合成。

一、DNA的理化性质

DNA是染色体的主要成分，是基因的物质基础。DNA最重要的特征是碱基序列，由四种脱氧核糖核苷酸排列成长链，两条长链互绕而成稳定结构，形成双螺旋结构。在DNA分子的每一条链中，磷酸基团（-PO₄）端属于5′端，因为在一个脱氧核苷酸中，磷酸连接在脱氧核糖的第5号碳原子上。

在细胞内，DNA能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体统称为染色体组。人正常的体细胞中含有46条染色体，染色体在细胞分裂之前已在分裂间期完成复制。细胞分裂间期又可划分为：G1期——DNA合成前期、S期——DNA合成期、G2期——DNA合成后期。动物、植物及真菌等真核生物，DNA主要存在于细胞质的拟核内。染色体上的染色质蛋白如组蛋白，能够将DNA进行组织并压缩，帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用，进而调节基因的转录活性。

DNA是高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很强的黏度，可被甲基绿染成绿色。DNA在A260nm有吸收作用，利用这一特性，可以对DNA进行浓度和纯度测定。当核酸变性时，吸光度升高，此时称为增色效应；当变性核酸又重新复性时，吸光度又将恢复至原来的水平。较高温度、有机溶剂、酸碱试剂等都可以引起DNA分子变性，即DNA分子内的氢键断裂。

质粒DNA是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1～200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋的状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，具有自主复制和转录能力，能在子细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。

二、基因组DNA分离纯化应遵循的原则

基因组DNA在细胞核中与组蛋白结合在一起，以核小体为单位，经过螺旋化，折叠盘绕压缩形成染色体。基因组DNA的分离是指将DNA与蛋白质、多糖和脂类等物质分开，然后纯化DNA的过程。双链DNA分子是非常惰性的化学物质，具有反应活性的碱基受磷酸基团和戊糖的保护，并通过碱基堆积力得以增强。因此，DNA比其他生物大分子可以保存更长的时间。尽管DNA分子比较懒惰，但当双链DNA分子从细胞核内释放出来，随机卷曲在缓冲溶液中时，碱基堆积力和磷酸基团之间的静电排斥力使整个溶液比较黏稠。大于150kb的DNA线性分子很容易被操作中产生的力剪切，因此动作要非常轻柔。一般而言，核酸的分离纯化应遵循以下原则：①操作中尽量减少振荡、搅拌对溶液中线性DNA分子的机械剪切破坏，保持DNA分子一级结构的完整；②防止和抑制DNA酶对基因组DNA的降解；③排除蛋白质和RNA大分子物质的污染。

三、基因组DNA分离纯化的基本原理与方法

真核生物都可以用来制备DNA，根据材料来源不同，采取不同的处理方法裂解细胞，随后的DNA提取方法大体类似。动物基因组DNA的提取方法有苯酚-氯仿抽提法、SDS裂解法、玻璃缠绕法和甲酰胺解聚法等。其中，甲酰胺解聚法提取的DNA分子比较大，适合用来构建基因组DNA文库；而SDS裂解法和玻棒缠绕法提取的DNA分子在100～150kb，是经典的基因组DNA提取方法。基因组DNA分离纯化大致分为材料的选择，基因组DNA的释放、纯化、浓缩和保存等主要步骤。

（一）材料的选择

临床常见的标本如血液、组织及体外培养的细胞等都可以作为核酸提取的原料，具体应根据实验目的来选择原料，优先选择容易采集和容易处理的标本。

（二）基因组DNA的释放

基因组DNA的释放主要指裂解细胞膜和核膜，之后将基因组DNA和蛋白质分离的过程。一般细胞裂解有机械法和非机械法两种。机械法主要是使用机械力使细胞破碎，但机械力容易引起相对分子质量较高的线性分子断裂，因而不适用于基因组DNA的分离。非机械法分为化学法和酶法两类。化学法指在一定的pH环境下，加入表面活性剂或去污剂，如十二烷基硫酸钠（SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等裂解细胞，使蛋白质变性，将核酸从细胞内释放出来。酶法指加入蛋白酶和溶菌酶使细胞壁和细胞膜破裂，降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。

在实际操作中可以同时采用化学法和酶法裂解细胞，释放DNA分子和RNA分子。苯酚-氯仿抽提法中裂解液含有金属离子螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）、RNA酶（RNase）、蛋白酶K和SDS。其中EDTA能抑制DNA酶的活性，保护基因组DNA在分离纯化过程中不被降解；RNase则可水解RNA，减少RNA对基因组DNA的污染；蛋白酶K可将大分子蛋白质降解成小肽或氨基酸，促进DNA分子的释放；SDS可结合细胞膜和核膜的蛋白质，破坏膜结构，使蛋白质解聚，促进DNA分子和蛋白质的分离。一旦DNA分子从细胞核中释放出来，应该注意操作中动作的轻柔性，避免剧烈震荡产生的剪切力对核酸的破坏。

（三）临床常见标本的裂解方法

1.血液

从全血中制备基因组DNA时，酸性柠檬酸葡萄糖溶液（ACD）抗凝剂优于EDTA抗凝剂。样本采集后可以在4℃存放半个月；若长期保存，应冻存于-80℃。血液样本应避免反复冻融，减少基因组DNA的断裂。血液中的有核细胞为白细胞，离心全血后应吸取中间的白膜层，或用红细胞裂解液裂解红细胞后，收集白细胞，裂解并提取基因组DNA。

2.组织

动物组织中含有大量纤维物质，在裂解组织前先用液氮研磨组织，有利于提高基因组DNA的产量。新鲜或冷冻的组织粉碎后，加入10倍体积裂解液裂解细胞，可将基因组DNA释放出来。石蜡包埋的组织先切成10µm切片，加入二甲苯溶蜡，再加入乙醇去二甲苯，风干乙醇后可加入裂解液裂解组织。由于福尔马林固定和石蜡的包埋，提取DNA的片段会有碎裂，其大部分在100bp～10kb，主要分布于100～1 500bp，适用于常规的PCR反应。

3.培养的细胞

将贴壁细胞消化，离心弃上清，收集下层细胞，或悬浮细胞离心后，收集下层细胞，用1×PBS洗涤3次后，将细胞沉淀重悬于pH 8.0的TE缓冲液，加入裂解液将细胞裂解，即可将基因组DNA释放到缓冲液中。

4.基因组DNA的纯化和浓缩

DNA的纯化是指DNA与蛋白质、盐类及其他杂质彻底分离的过程。经典的DNA纯化方法是苯酚-氯仿抽提法。细胞或组织被裂解后，成为含核酸分子、蛋白质和盐等混合物，加入等体积的Tris平衡苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）的混合液，混匀后离心收集含核酸的水相，变性的蛋白质则留在有机相中。其中，酚经Tris平衡后不仅使蛋白质变性，同时可防止酚吸收更多的DNA溶液，降低DNA在有机相中的停留。氯仿能增加有机相的密度，促进两相分离，同时能溶解少量的苯酚，减少酚在水相中的残留。异戊醇可以减少变性过程产生的气泡并促进有机相与水相的分层。需要注意的是，提取DNA采用的苯酚是pH 8.0的Tris平衡液，DNA在这个pH环境下比较稳定，容易进入水相。在含核酸的水相中加入醋酸钾（KAc）或醋酸钠（NaAc），Na⁺中和DNA分子中磷酸基团的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使DNA易于聚集沉淀。在水相中加入2～2.5倍体积的无水乙醇，沉淀、离心得到的核酸可以用70%乙醇洗涤除去多余的盐，可获得一定纯度的核酸。

在实验操作中应该根据目的选择相应的纯化方法。苯酚-氯仿法提取的基因组DNA去蛋白效果比较好，但历时比较长。如提取的基因组DNA直接用于PCR反应时，可以用SDS裂解法快速抽提。此法利用去污剂乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P-40，NP-40）破红细胞膜，收集白细胞，用SDS裂解后，加入高浓度NaCl溶液盐析蛋白，离心收集水相后，乙醇沉淀DNA，也可抽提到一定纯度的DNA。通过SDS裂解法提取的基因组DNA为20～50kb，适用于PCR反应等实验。

除此之外，还可用层析法分离基因组DNA。目前生物公司开发的商品试剂盒，采用硅胶膜吸附法和磁珠法，可提供一定的离子环境，核酸被选择性地吸附到硅土、硅胶或磁珠表面而与其他生物分子分离。

5.DNA浓度及纯度的鉴定

DNA分子的碱基含有共轭双键，在260nm波长处有最大紫外吸收，可以利用这一特性对DNA进行定量和纯度分析。采用紫外分光光度法测定，A260/A280比值是纯度鉴定的重要指标。纯的DNA A260/A280之比应在1.8。当A260/A280比值＜1.7时，说明样品中含蛋白质成分过高；当A260/A280比值＞2.0时，说明样品中有部分降解或有RNA污染。

6.基因组DNA的保存

将纯化后的基因组DNA用弱碱性的Tris或者TE缓冲液溶解，缓冲液中的EDTA可以抑制DNA酶，从而防止DNA降解。核酸的稳定性与温度成反比，与浓度成正比，一般保存在-20℃或-80℃的冰箱。

四、全血DNA提取实验方案

（一）实验原理（吸附柱法）

蛋白酶K能快速破碎细胞并灭活其中的核酸酶，DNA在盐溶液中可以选择性吸附在硅胶质膜上，去蛋白溶液将DNA中存在的蛋白质去除、去盐溶液可以将细胞代谢物等杂质去除，洗脱缓冲液将纯净DNA从硅胶质膜上洗脱下来（图3-1）。

（二）实验材料

1.样本

新鲜血液。

2.试剂、试剂盒

无水乙醇、天根核酸提取试剂盒。

3.仪器、耗材

离心机、金属浴、振荡仪、加样枪、枪头、离心管。

（三）实验步骤

1.处理血液样本

（1）如果血液样品体积小于200µL，可加缓冲液GS补足体积至200µL，之后即可进行下一步实验。

（2）如果血样体积超过200µL，需用细胞裂解液CL处理，具体步骤如下：在样品中加入1～2.5倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10 000 rpm离心1min，吸弃上清，留下细胞核沉淀，加200µL缓冲液GS，并彻底振荡混匀。

（3）如果处理血样为低级生物的抗凝血液，其红细胞往往为有核细胞，因此处理量比较少，为5～20µL，可加缓冲液GS补足200µL后，进行下面的裂解步骤。

2.加入20µL Proteinase K溶液，混匀。

3.加200µL的GB缓冲液，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，溶液应变得清亮。（注意：加入缓冲液GB时可能会产生相应的白色沉淀，一般37℃放置时会消失。当血液体积≤200µL且没有采用红细胞裂解液处理时，水浴后颜色可能为深褐色，应当注意溶液中有无团块等沉淀出现。）

4.加200µL无水乙醇，充分颠倒，可能会出现絮状沉淀。

5.将上一步所得溶液，以及可能出现的絮状沉淀都加到一个吸附柱CB3中，12 000rpm离心30s，将收集管里的废液倒掉，将吸附柱CB3放入其中。

6.向吸附柱CB3中加入500µL缓冲液GD，12 000rpm离心30s，将收集管中的废液倒掉，将吸附柱CB3放入收集管中。

7.加入600µL漂洗液PW到吸附柱CB3中，12 000rpm离心30s，将收集管中的废液倒掉，将吸附柱CB3放入收集管中。

8.重复操作步骤7。

9.2 000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3开盖置于室温中，放置数分钟，彻底晾干吸附柱残余的漂洗液。

10.将吸附柱CB3转入1.5mL离心管中，在吸附膜中间位置悬空滴加50～200µL洗脱缓冲液TB，室温静置2～5min，12 000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中（注意：为增加基因组DNA的获得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12 000rpm离心2min。洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响）。将获得的DNA保存在-20℃，以防DNA被降解。

（四）吸附柱法提取DNA的注意事项

1.样品避免反复冻融，否则使DNA降解，片段较小、提取量有所下降。

2.缓冲液GB中如有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，摇匀后使用。

3.所有离心步骤均使用台式离心机，室温下离心。

五、质粒DNA提取实验方案

（一）实验原理（碱裂解法）

离心柱型质粒DNA提取试剂盒采用改进的SDS-碱裂解法裂解细胞，吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将杂质和其他细菌成分去除，最后用低盐、高pH的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

（二）实验材料

1.实验器材

台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、记号笔、电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。

2.实验耗材

无菌2mL/1.5mL EP管、各规格Tip、一次性手套等。

3.实验试剂

质粒小提试剂盒（离心柱型，YRBIO）、LB培养基、抗生素等。对数期菌株（pEGFP-N1 in DH5α）。

4.碱裂解法试剂配方

试剂配方见表3-2。

（三）实验方法

1.将细菌沉淀，所得重悬于100µL用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使细菌沉淀在溶液Ⅰ中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。

2.加200µL新配制的溶液Ⅱ。盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。

3.加150µL用冰预冷的溶液Ⅲ。盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10s，溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3～5min。

4.用微量离心机4℃、12 000rpm离心5min，将上清液转移到另一离心管中。

5.用2倍体积的乙醇于室温沉淀双链DNA。振荡混合，于室温放置2min。

6.用微量离心机4℃、12 000rpm离心5min。

7.小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除尽。除去上清液的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。

8.用1mL 70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤7所述方法去掉上清液，在空气中使核酸沉淀干燥10min，即可制备高拷贝数质粒（如Xf3或pUC），其产量一般为每毫升原细菌培养物3～5µg。