第三节　生物样本存储

低温环境能长期保护样本中生物大分子信息的完整性，维持细胞和组织活性，为生物医学科学研究提供保障。所有低于体温（37℃）的保存都可称为低温保存。不同类型的样本其保存方法也不同，特别是有活性的和无活性的样本。目前生物样本及其提取产物主要有深低温和常温两大类保存方式，针对不同科研需求，更多的样本保存方式也不断问世，但各种方式的保存效率不尽相同。为了保证采集完的样本在较长时间内的质量，大多数都需要在低温条件下保存。

一、储存温度对样本的影响

根据生物样本种类的不同，目前生物样本通常的保存温度分为室温、4℃、-20℃、-80℃和-196℃（液氮）。室温下可以较长时间保存固定的组织切片和石蜡包埋组织；4℃可以短时间保存待处理的血液和DNA等样本；-20℃可以较长时间保存DNA样本；-80℃可以较长时间保存RNA、蛋白质、细胞和组织样本；-196℃可以长期保存细胞和组织样本。

冷冻保存是最常用的方法。冷冻既可以终止样品中酶的活性，又可以储存样品。在某些情况下若收集的样品来不及冷冻处理，可先将其置于冰屑中，然后再行冷冻储存。生物样本的长期储存，通常使用尽可能低的温度来降低样本内的生化反应，提高样本内各种成分的稳定性。生物大分子、细胞、组织的常用储存温度为-80℃（超低温冰箱）或-196℃（液氮液相），其保存效果更佳，已成为一种被广泛接受的生物样本长期保存方式。

-80℃是样本保存的常用温度。-80℃低于危害性较大的水分结晶温度范围，也是常用超低温冰箱所能达到的温度。考虑到操作简便性、储存量和成本等因素，此温度也是目前保存样本中生物大分子活性的常用温度。然而，对不同的生物大分子活性来说，此温度环境下到底能保持多久仍然处于研究探索中。组织中DNA的稳定性较好，可以在-80℃保持数年或更长时间，但RNA则容易被广泛分布于细胞和各种组织的RNA酶降解。不同细胞和组织中的RNA在稳定剂中的储存时间也有较大区别，一般不超过5年。在一些实验内，RNA在-80℃环境下不到1年就被测出有降解情况。所以为长期保存RNA活性，建议使用更低的温度，或者利用含有RNA保护液的专用冻存管储存。RNAlater溶液是一种水溶性、无毒性组织储存试剂，其可迅速渗透到组织内以稳定和保护细胞的RNA。其他样本内的蛋白质和脂类等生物大分子在-80℃下也能保存，但时间长短不一，稳定性随时间延长逐渐衰减。为保护样本已知特定的生物大分子，可加入该分子的稳定剂，如果需研究样本中未知的生物分子，建议使用更低温度储存。

-196℃是液氮挥发的温度，只有液氮液相保存技术能达到此温度。液氮保存样本是目前公认最可靠的方式，样本内的生理、生化活动在此温度下基本停止，样本在此温度下可长期保持稳定。液氮保存是长期保存样本内细胞活性、组织器官的复杂结构及活性的最有效方法，已被广泛接受与认可。然而，由于样本完全浸没在液氮中，游离的组织碎片可能会带来交叉生物污染的潜在风险，因此催生了气相液氮（-150℃）这种新型保存方式。所谓气相液氮保存，就是将样本置于液态氮以上、气相氮的包围中，可以很好地避免交叉污染的风险。从理论上说，该温度可以满足样本的长期保存需求。因为-137℃是水的玻璃化温度，低于此温度时细胞内能导致内容物降解的一切生化反应均处于失活状态，因此-150℃深低温可长期保存样本并保证其质量。

二、储存温度的选择

选择储存温度，应考虑样本的类型、预期储存的时间、样本中生物分子的特性等。细菌和细胞的临界温度通常认为是-140℃，在这个温度下，所有的代谢活动停止，对于能承受在此温度下保存的样本，建议选择低于这个温度进行储存，利于长期稳定的储存。一些样本不能承受这么低的温度，储存温度一般选择-80℃，在此温度下代谢活动并没有完全停止。另外，一些经过特殊处理的样本则可在低温和室温条件下储存。

（一）细胞的储存温度

长期保存的细胞系应储存在液氮中，气相液氮比液相液氮储存样本更好。虽然液相液氮的温度更低（-196℃），但气相液氮的温度（-150℃）仍在临界温度之下。对于需要但没有条件使用液氮保存的细胞样本应至少储存在-80℃环境中。

（二）液体样本的储存温度

对于液体样本，包括血液和尿液，样本中的各种成分应在储存前分离，使得每一种成分能够在最佳条件下储存。全血、血清、血凝块、非淋巴细胞和血浆样本应储存在-80℃。血沉棕黄层和白细胞应储存在液氮中。尿液应储存在-80℃或者液氮中。

（三）固体组织样本的储存温度

长期储存的新鲜冰冻组织和包埋冰冻组织应储存于液氮中，冰冻组织切片或者用于DNA和RNA提取的冰冻组织应储存在-80℃。

福尔马林固定技术广泛应用于组织学、免疫组织化学等领域。经过福尔马林固定的石蜡包埋组织及组织切片应储存在室温，在低于27℃的环境下，能控制虫患和湿度，且可长期保存。

三、样本的冻存和复温

选择好储存温度就要对采集的样本先进行冻存，再储存到适合的容器和设备中。样本在冻存过程中应采用合适的冷却速率，控制冰晶大小以及冰晶形成速度，这些将影响样本中细胞的复苏。

1.样本应储存在稳定的条件下，避免反复冻融。样本反复冻融会加快生物大分子物质的降解，严重影响样本质量。

2.样本在冻存前，最好分装成小份样本再储存，可以避免不必要的反复冻融，一般够一次研究用量即可。当需要冻融样本时，应按照标准流程确保样本的稳定性和质量。

3.样本在冻存过程中应采用合适的冷却速度，控制冰晶大小以及冰晶形成速度，这些将影响样本的质量。统一的冷却速率是从室温开始每分钟降1℃直到-80℃，适用于大多数细胞。

4.样本使用时，需要采取必要的融化和复苏。储存的温度越低，所需的时间越长。从冷冻状态中解冻，最好的方式是37℃水浴，过程不宜太长，避免损害样本的生物活性。

四、储存容器的选择

样本的储存容器必须稳定，所有的样本被严格地储存在合适的容器中。用于储存样本的容器，应能承受骤然降温到超低温，在低温下可以密封，并长时间储存在低温下。为了方便未来有预期计划的研究，样本应被分装成小份量存储以减少反复冻融对样本质量的降解和不必要的耗损。

五、储存设备的选择

样本需要低温储存但不需冰冻时，应选择冷藏室，温度应保持在2～8℃的范围，如固定的石蜡包埋组织及组织切片等。当样本需要冰冻保存时，应选择-20℃冰箱或-80℃低温冰箱，如冰冻组织切片或者用于DNA和RNA提取的冰冻组织、全血、血清、血浆、血凝块等。对低温温度有更高要求的样本，应选择使用-196℃液氮储存。

（林秋雄　张梦珍）