二、物理灭菌法

物理灭菌法(physical sterilization)系指采用加热、射线和过滤等方法杀灭或除去微生物的技术。

(一)热力灭菌法(heat sterilization)

加热可以破坏蛋白质与核酸中的氢键，导致蛋白质变性或凝固，核酸破坏，酶失去活性，致使微生物死亡。热力灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌，灭菌所需热量与灭菌量、灭菌时间、湿含量等有关。

1.干热灭菌法　干热灭菌法(dry heat sterilization)系指将物品置于干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备中，利用干热空气达到杀灭微生物或消除热原物质的方法。适用于耐高温但不宜用湿热灭菌法灭菌的物品灭菌，如玻璃器具、金属制容器、纤维制品、陶瓷制品、固体试药、液状石蜡等均可采用本法灭菌。缺点是穿透力弱，温度不易均匀，而且灭菌温度较高，灭菌时间较长，不适于橡胶、塑料及大部分药品的灭菌。

由于干燥状态下微生物的耐热性强，必须长时间受高热的作用才能达到灭菌的目的。干热灭菌条件的选择应考虑被灭菌物品的热稳定性、热穿透力、生物负载(或内毒素污染水平)等因素。干热灭菌条件通常采用温度-时间参数结合或者结合FH值(标准灭菌时间，系灭菌过程赋予被灭菌物品160℃下的等效灭菌时间)综合考虑。温度范围一般为160～190℃，当用于除热原时，温度范围一般为170～400℃。如选择160～170℃ 120min以上、170～180℃ 60min以上或250℃ 45min以上，250℃ 45min可除去无菌产品包装容器及有关生产灌装用具中的热原。采用干热灭菌时，被灭菌物品应有适当的装载方式，包括最大和最小的装载量、排列方式等，对于连续干热灭菌设备还应考虑传送带运转时不同位置可能产生的温度差异，同时应关注热力难以穿透的物品，以保证灭菌的有效性和重现性。

无论采用何种灭菌条件，均应保证灭菌后的物品的PNSU≤10-6。采用干热过度杀灭后的物品一般无须进行灭菌前污染微生物的测定。

2.湿热灭菌法(moist heat sterilization)　湿热灭菌法系指将物品置于灭菌设备内利用饱和蒸汽、蒸汽-空气混合物、蒸汽-空气-水混合物、过热水等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。此法灭菌能力强，为热力灭菌中最有效、应用最广泛的灭菌方法。药品、容器、培养基、无菌衣、胶塞以及其他遇高温和潮湿性能稳定的物品，均可采用本法灭菌。

湿热灭菌条件的选择应考虑被灭菌物品的热稳定性、热穿透性、生物负载等因素。湿热灭菌通常采用温度-时间参数或者结合F0值综合考虑。无论采用何种灭菌温度和时间参数，都必须证明所采用的灭菌工艺和监控措施在日常运行过程中能确保物品灭菌后的PNSU≤10-6。对热稳定的物品，灭菌工艺可首选过度杀灭法，以保证被灭菌物品获得足够的无菌保证值。热不稳定性物品，其灭菌工艺的确定依赖于在一定的时间内，一定生产批次的被灭菌物品灭菌前微生物污染的水平及其耐热性。因此，日常生产全过程应对产品中污染的微生物进行连续地、严格地监控，并采取各种措施降低物品微生物污染水平，特别是防止耐热菌的污染。热不稳定性物品的F0值一般不低于8min。

采用湿热灭菌时，被灭菌物品应有适当的装载方式，应考虑被灭菌物品最大、最小和生产过程中典型的装载量和排列方式等，以保证灭菌的有效性和重现性。

(1)热压灭菌法　是采用高压饱和水蒸气加热杀灭微生物的方法。此法具有很强的灭菌效果，灭菌可靠，能杀灭所有细菌繁殖体和芽孢，是在制剂生产中应用最广泛的一种灭菌方法。通常采用121℃ 15min、121℃ 30min或116℃ 40min的程序，适用于能耐高压蒸汽的药物制剂、玻璃容器、金属容器、瓷器、橡胶塞、膜过滤器等物品的灭菌。

常用的热压灭菌器有手提式热压灭菌器、立式热压灭菌器和卧式热压灭菌柜等。使用时必须严格按照操作规程操作，防止事故发生。国内绝大多数获得GMP认证的注射剂车间已经采用全自动灭菌器，根据灭菌温度和时间的设定条件将操作温度与时间自动记录与控制，自动计算出F0值，以判断灭菌的完全与否。

(2)流通蒸汽灭菌　是在常压下使用100℃流通蒸汽加热杀灭微生物的方法。通常灭菌时间为30～60min。适用于消毒及不耐高热的制剂的灭菌，但不能有效杀灭细菌芽孢，系非可靠的灭菌法，一般可作为不耐热无菌产品的辅助灭菌手段。

(3)煮沸灭菌法　是把待灭菌物品放入沸水中加热灭菌的方法。通常煮沸30～60min。此法灭菌效果差，常用于注射器、注射针等器皿的消毒。必要时加入适当的抑菌剂，如甲酚、氯甲酚、苯酚、三氯叔丁醇等，以提高灭菌效果。

(4)低温间歇灭菌法　将待灭菌的物品，用60～80℃水或流通蒸汽加热1h，杀灭其中的细菌繁殖体，然后在室温或37℃恒温箱中放置24h，使其中残存的芽孢萌发成繁殖体，再进行加热将其杀灭。反复进行3～5次，直至消灭芽孢为止。适用于不耐高温热敏感物料和制剂的灭菌。缺点是：费时，工效低，且芽孢的杀灭效果往往不理想，必要时加适量的抑菌剂，以提高灭菌效率。

(5)影响湿热灭菌的因素　①不同细菌的不同发育期与数量：不同细菌，同一细菌的不同发育阶段对热的抵抗力有所不同；繁殖期对热的抵抗力比衰老时期大得多，细菌芽孢的耐热性更强；细菌数越少，灭菌时间越短。如注射液在配制灌封后应立即灭菌，可缩短整个灭菌时间，且能使灭菌充分。②灭菌温度与灭菌时间：一般来说，灭菌时间与灭菌温度相关，高温灭菌即可缩短灭菌时间，但温度越高，药物的分解速度加快；低温长时间灭菌，也会增加药物的分解量。为保证药物的稳定性与有效性，应在达到有效灭菌的前提下适当选择灭菌温度和灭菌时间。③蒸汽的性质：蒸汽有饱和蒸汽、湿饱和蒸汽和过热蒸汽。饱和蒸汽热含量较高，潜热大，穿透力大，灭菌效力高。湿饱和蒸汽带有水分，热含量较低，穿透力差，灭菌效力较低。过热蒸汽温度高，但穿透力差，灭菌效率低。④介质的性质：制剂中含有营养物质，如糖类、蛋白质等，增强细菌的抗热性。细菌的生活能力也受介质pH的影响：一般中性环境的耐热性最好，碱性次之，酸性不利于细菌的发育。⑤被灭菌物品的种类、大小、灭菌载量和装载方式，也会影响灭菌效果。

(二)射线灭菌法(radiation sterilization)

1.辐射灭菌法(radiation sterilization)　辐射灭菌法系指利用电离辐射杀灭微生物的方法。常用的辐射射线有60Co或137Cs衰变产生的γ射线、电子加速器产生的电子束和X射线装置产生的X射线。射线可使有机化合物的分子直接发生电离，产生破坏正常代谢的自由基，导致微生物体内的大分子化合物分解。辐射灭菌的特点是不升高被灭菌物品的温度，穿透性强，适用于不耐热药物的灭菌。能够耐辐射的医疗器械、生产辅助用品、药品包装材料、原料药及成品等均可用本法灭菌。

灭菌时，应采用剂量剂对灭菌物品吸收的辐射剂量进行监控，剂量计放置的位置应经验证确定，以充分证实灭菌物品吸收的剂量是在规定的限度内。

我国对γ射线用于中药灭菌也进行了研究。因辐照灭菌应用于传统中药的灭菌历史尚短，基础研究需不断完善，故中药采用辐照灭菌应充分说明其必要性。《中药辐照灭菌技术指导原则》(2015年)规定：中药采用辐照灭菌应以不影响原料或制剂的安全性、有效性及稳定性为原则。辐照灭菌技术不能替代药品生产的GMP管理，中药药品生产过程中必须严格执行GMP规范，各个生产环节应设置降低微生物负载的措施，严格药材的挑选、清洁、炮制等加工环节，不应当将采用辐照灭菌作为降低药品微生物负载的唯一途径。

辐射灭菌设备费用高，对某些药品可能降低效力、产生毒性或发热物质，同时要注意安全防护等问题。

2.紫外线灭菌法(ultraviolet sterilization)　紫外线灭菌法系指用紫外线照射杀灭微生物的方法。一般用于灭菌的紫外线波长是200～300nm，灭菌力最强的波长是254nm。紫外线作用于核酸蛋白促使其变性，同时空气受紫外线照射后产生微量臭氧，从而起共同杀菌作用。紫外线进行直线传播，可被不同的表面反射，穿透力微弱，但较易穿透清洁空气及纯净的水。适用于物品表面的灭菌、无菌室空气及蒸馏水的灭菌；不适用于药液和固体物质深部的灭菌；普通玻璃容器可吸收紫外线，因此装于其中的药物不能用此法灭菌。紫外线对人体照射过久，会发生结膜炎、红斑及皮肤烧灼等现象，故一般在操作前开启1～2h，操作时关闭。

3.微波灭菌法(microwave sterilization)　微波灭菌法系指微波照射杀灭微生物和芽孢的灭菌方法。微波是一种高频、短波长的电磁波。微波灭菌法通常采用的微波频率范围是300MHz～300GHz。

适用于以水为溶剂的液体药剂、中药饮片及固体制剂的灭菌。具有低温、常压、省时(灭菌速度快，一般为2～3min)、高效、均匀、保质期长(不破坏药物原有成分，灭菌后的药品存放期可增加1/3以上)、节约能源、不污染环境、操作简单、易维护等优点。

(三)过滤除菌法(filtration sterilization)

过滤除菌法系指采用物理截留去除气体或液体中微生物的方法。这是一种机械除菌的方法，这种机械叫除菌过滤器。常用于气体、热不稳定溶液的除菌。

繁殖型细菌大小一般>1μm，芽孢≤0.5μm。对于以表面过筛作用截留的除菌滤器，其孔径必须小到足以阻止细菌和芽孢进入滤孔之内，例如纤维素酯膜滤器的筛孔大小约为0.2μm；对于阻留于孔道内或静电作用截留的除菌滤器，其孔径可稍大于所需滤除的菌体，但压力过大或波动，菌体有被挤过的可能。

供除菌用的滤器，要求能有效地从溶液中除净微生物，溶液顺畅地由滤器通过，滤液中不落入任何不需要的物质，滤器容易清洗，操作简便。除菌过滤器一般选用孔径0.22μm(或更小孔径或相同过滤效力)；常用的除菌过滤器有G6号垂熔玻璃漏斗、微孔薄膜滤器、孔径在1.3μm以下的白陶土滤柱等。

通过过滤除菌法达到无菌的产品应严密监控其生产环境的洁净度，应在无菌环境下进行过滤操作。相关的设备、包装容器及其他物品应采用适当的方法进行灭菌，并防止再污染。