1.4　飞秒激光生物光子学

飞秒激光技术在生物研究中逐步获得了越来越多的交叉和应用。超短的飞秒脉冲使得人类首次可以对生物样本实现在分辨时间上达到飞秒量级的无创式精确操作。同时，飞秒脉冲内超高的峰值功率使得光与物质的相互作用以非线性过程为主，这种相互作用的有效范围仅仅是非线性区域，使得空间分辨率突破了衍射极限而达到了百纳米量级。

从20世纪90年代开始，人们首先将飞秒激光的非线性过程用于细胞成像的荧光激发。显微成像是研究生物学（特别是细胞生物学和分子生物学）最为核心的技术手段，高分辨率的显微成像在一切与生物相关的研究中都有重要的应用和研究价值。成像分辨率是显微成像最为重要的指标。传统的荧光成像和共聚焦扫描显微镜提供了衍射极限的分辨精度（500 nm附近），但对于若干生物大分子和细胞结构仍显不足；而近场和扫描电子显微镜则无法保持对生物样本的活体观测和荧光标记。此外，由于可见光波段在组织中会被散射和吸收，传播深度会随之降低，因此严重限制了组织的荧光成像。飞秒激光的超高峰值功率为生物中的非线性激发提供了技术基础，在在体动物成像和组织荧光显微成像中可能会有一些成像深度和分辨率上的优势。但是，基于飞秒激光的多光子成像系统昂贵而庞大，在很多细胞水平的研究中并不比共聚焦扫描显微镜具有明显的优势。因此，在较长的一段时间内，飞秒激光在生物领域的应用主要停留在技术研究的层次，而缺少实际意义上的应用，没有真正去解决一些生命科学中的重大问题。

在2005年光遗传学技术出现后，脑科学和神经科学研究发生了革命性的变化，而对活体动物的脑神经荧光成像的需求急速增加。基于飞秒激光的多光子显微成像技术与神经科学的研究快速结合，并获得了广泛的应用，取得了一系列重大突破。图1.18所示为鼠的大脑皮层和海马区的三光子显微成像。由于飞秒脉冲具有优异的时域特性以及近红外波段的散射和吸收特性，它在组织中具备了比连续光或长脉冲好得多的传播优势。近期，通过飞秒激光对脑中的神经元成像，以及飞秒激光对神经元内光遗传蛋白的双光子激发，哈佛大学医学院的课题组首次发现了视觉皮层神经元的竞争机制。而斯坦福大学的Karl Diesseroth组首次通过少数几个神经元的刺激调控，以及通过飞秒激光的双光子激发刺激，实现了对视觉的植入。哥伦比亚大学的Yuste小组使用飞秒激光对小鼠的运动神经元进行观测和刺激，实现了只通过几个神经元的双光子刺激即可控制小鼠的行为。

图1.18　鼠的大脑皮层和海马区的三光子显微成像

21世纪以来，利用飞秒激光对细胞的精确手术和离子调控（例如对钙离子的调控，其示意图如图1.19所示），也在近年取得很多重大的突破。飞秒激光具有长脉冲间隔且波长对于生物样本较为安全，可以对生物样本进行较长时间的照射，因此在衍射极限精度的精密细胞手术在转基因、细胞生理过程和骨架的研究、细胞融合、神经组织再生、分子信号调控等多领域都取得了很大的进展。例如，飞秒激光在紧致聚焦时仅在聚焦区域产生极高的能量密度，从而实现蚀除线粒体、切割染色体等亚细胞级的细胞手术；飞秒激光转基因技术首次使得生物大分子（如RNA），以及一些特殊的蛋白质等被转染到细胞内成为可能；通过这项技术，人们可以有效地研究一些特殊疾病的机理，控制干细胞分化，控制诱导细胞变种，生产单克隆抗体等，这将有可能在癌症治疗、干细胞科学等领域实现突破。

图1.19　激光对钙离子的调控示意图

因此，飞秒激光生物光子学为一些针对基因、癌症，以及细胞生物学的研究提供了新的切入方法，在一定程度上摆脱了传统生物化学手段的限制。这种新的光学方法具备了一些全新的特征，为很多研究提供了新思路、新视角，为进一步研究探索生命科学中的新问题、新现象，以及最终在临床上的应用提供了可能。