第三节　靶点的筛选技术

分子影像学将分子生物学技术和现代医学影像学相结合，探索疾病过程中细胞和分子水平的异常，从而有助于疾病的早期诊断和治疗。运用高特异性的成像探针，是分子影像学显示分子信息即内源性分子靶点表达成像的关键所在，而新探针的研制和开发，常涉及以下分子生物学技术。

一、cDNA文库构建

cDNA文库是从某真核生物mRNA反转录形成的cDNA片段与载体（常用噬菌体或质粒载体）连接形成的克隆集合，代表特定发育阶段表达的全部mRNA。特点是其中不含内含子和其他调控序列。cDNA文库的构建和筛选是基因克隆的重要方法之一，也是目前发现新基因和研究基因功能的基本工具之一。从cDNA文库中可以筛选到目的基因，并进一步用于探针作用的靶点。下面介绍几种常用的文库构建方法，这些方法各有优缺点，应用时须结合具体情况进行选择，以达到预期的目的。

（一）经典cDNA文库

经典cDNA文库构建的基本原理是获得高质量的mRNA，然后用Oligo（dT）或随机引物，反转录合成cDNA，两端添加适当的连接接头，酶切后连接到适当的载体中获得文库。

经典cDNA文库的构建高效、简便，但存在以下几方面不足：①文库克隆的片段一般较短，单个克隆上的DNA片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因cDNA；②细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的mRNA要求很高的克隆数；③所需mRNA量大，不可能以少数细胞或组织为材料构建所需的cDNA文库；④筛选经典cDNA文库操作复杂，限制了基因克隆的速度。

（二）全长cDNA文库

全长cDNA文库是指从生物体内一套完整的mRNA分子经反转录而得到的DNA分子群体，是mRNA分子群的一个完整的拷贝，代表真正的cDNA文库全长，不仅能提供完整的mRNA信息，而且可以通过基因序列对比得到mRNA剪接信息，利于后期蛋白质表达及功能分析。此外，全长cDNA文库是高效、大规模获得基因序列信息的一条有效途径，尤其是对基因组庞大，近期内尚不能进行全基因组测序的生物来说更是进行功能基因组研究的一条重要途径。目前，全长cDNA文库的构建方法主要有CAPture法、Oligo-capping法、SMART法、Capselect法、Cap-jumping法以及Cap-trapper法等。所有这些方法都着眼于真核生物mRNA 5′端的帽子结构，但又各具独到之处。总的来说，每种方法都存在一定的缺陷。综合比较而言，这六种方法中，SMART法和Cap-trapper法比较有实际应用价值。Cap-trapper法虽然所建文库全长率高，冗余性低，建库效率高，是目前构建高质量文库最好的方法，但对实验技术要求较高，实验过程复杂，操作烦琐。SMART法适于简单、快速地构建一般质量的cDNA文库。

利用 SMART（switching mechanism at 5′ end of the RNA transcript）技术建库，可以得到全长cDNA文库。该方法只需要少至25ng的mRNA或者50ng的总RNA，就可以得到能够代表原有样品中mRNA丰度的cDNA。构建的关键在于合成cDNA的反应物中事先加入了3′末端带Oligo（dG）的SMART引物。

反转录酶以mRNA为模板合成cDNA，当达到mRNA的5′末端碰到真核特有的帽子结构，即甲基化的G时，在合成的cDNA末端连续加上几个dC。SMART的引物Oligo（dG）与cDNA末端的连续dC配对，反转录酶自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板，继续延伸cDNA直到引物的末端。这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列。合成第二链后利用通用引物进行扩增。只有5′帽子结构完整的mRNA才能利用这个反应进行扩增，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。

（三）均一化cDNA文库

均一化cDNA文库包含某一特定组织或细胞的所有表达基因，且在cDNA文库中表达基因对应的cDNA的拷贝数相等或接近，从而克服基因转录差异给文库筛选及分析带来的障碍，便于研究基因的表达和序列分析。均一化cDNA文库有以下几个优点：①经济实用，能节约大量试验成本；②原始丰度mRNA拷贝相对应的cDNA探针与均一化cDNA文库作杂交，可以估算出大部分基因的表达水平及发现一些组织特异性基因；③克隆低丰度mRNA的机会增加，可应用与各发育阶段或各组织的基因表达分析及突变检测；④可用于遗传图谱的制作和大规模原位杂交，还可以用于大量测序与芯片制作等研究。

基因的转录水平和表达能力存在巨大差异，绝大多数基因处于中等或低等表达丰度。构建均一化cDNA文库有以下两种观点：①基于复性动力学原理，高丰度的cDNA在退火的条件下复性速度快，而低丰度的cDNA需要很长时间，从而可以通过控制复性时间来降低丰度；②基于基因组DNA在拷贝数上具有相对均一化的性质，通过cDNA与基因组DNA饱和杂交而降低在文库中高拷贝存在的cDNA的丰度。目前，均一化cDNA文库构建的常用方法包括饱和杂交均一化法、寡核苷酸序列指纹均一化法、复性式均一化法和双链特异性核酸酶（Duplex-Specific Nuclease，DSN）均一化法。最为常用的均一化方法为DSN均一化法。DSN是最近发现的一种热稳定核酸酶，该酶能够选择性降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA，对单链核酸分子几乎没有作用。热稳定核酸酶DSN的应用，避免了测序过程中大量相同基因序列的干扰，提高了低丰度基因的筛选概率。由于DSN均一化法操作步骤简单，所需要的起始材料少，具有良好的应用前景。

DSN与SMART技术相结合法构建全长均一化cDNA文库是最为常见的方法。操作步骤如下：将特定时期的特定组织研磨提取总RNA，利用SMART技术反转录得到第一链cDNA，然后采用LD-PCR（Long-Distance PCR）对其扩增、纯化产物，使用DSN处理全长cDNA文库，二次扩增均一化后的cDNA，经消化、酶切、分离，去除小于400bp的片段，最终得到的dscDNA与载体连接并转入感受态细胞，培养所得即为原始的全长均一化cDNA文库。

（四）全长均一化/差减cDNA文库

全长均一化/差减cDNA文库最早由Carninci等人提出，整个文库的构建过程可分为3个部分：全长cDNA的获得；均一化/差减处理；双链cDNA的合成及文库的获得。这3个部分中，除均一化/差减处理外，其他两部分的方法和步骤与Cap-trapper法都相同。在进行均一化/差减处理时，需要将全长ss-cDNA作为tester与用生物素标记的过量的driver mRNA杂交，用磁珠分离法将高表达的cDNA除去，最终得到稀有表达的单链cDNA（single stranded cDNA，ss-cDNA）。

该方法不仅综合了构建全长和均一化/差减文库的技巧，而且又有许多独特的创新，克服了DNA杂交过程中的一些困难，文库质量得到较大提高。

（五）消减cDNA文库

消减cDNA文库也称扣除文库，是一种富含目的基因序列的cDNA文库。消减杂交是构建消减cDNA文库的核心，消减文库是否构建成功很大程度上取决于消减杂交的效率。

消减DNA文库构建的基本过程是：将要进行比较的两种组织或者细胞来源的mRNA样品反转录为cDNA，把含有目的基因的一方称为检测子（tester），不含目的基因的一方称为驱动子（driver）。在一定条件下用检测子与大大过量的驱动子进行杂交，选择性地去除两部分共同基因杂交形成的复合物，往往进行多次杂交-去除过程，最后将含有相关目的基因的未杂交部分收集后，连接到载体形成文库。

（六）固相cDNA文库

构建固相cDNA文库需基于传统的cDNA合成方法，并且在cDNA合成过程中引入固相支持物。Thomas Roeder在1998年提出新的cDNA文库固相合成方法，所用的酶和试剂与传统方法完全相同。不同的是cDNA的合成和修饰均在固相支持物——磁珠上完成。cDNA通过一个生物素固定在链霉素偶联的磁珠上，这样在反应过程中就可以简便而迅速地实现酶和缓冲液的更换，因此它将快速与高质量的文库构建结合在一起并且构建的文库适合大多数的研究目的。

虽然cDNA文库的用途很多，但是应用于分离感兴趣的靶基因是其最重要的用途。不管哪种类型的cDNA文库，都可以用于分离靶基因，只是使用的方法有差异。分离方法主要有两种：①对于非全长cDNA文库，即经典cDNA文库或消减cDNA文库，需要利用已经获得的cDNA序列片段，通过快速扩增cDNA末端法（rapid amplification of cDNA end，RACE）获得靶基因的全长序列；②对于全长cDNA文库，利用其与靶基因片段作为探针进行杂交筛选。

二、差异基因表达

各种生物的基因组均含有一定数量的基因。基因的表达按特定的时间和空间顺序有序地进行着，这种表达的方式即为基因的差异表达。通过比较同一类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达差异，可为分析生命活动过程提供重要信息。

差异基因表达（differential gene expression，DGE）技术主要有mRNA差异显示、消减杂交、cDNA的代表性差异分析、抑制消减杂交、cDNA扩增片段长度多态性、基因表达系列分析和基因芯片技术等。这些方法各有特点，各有利弊，应用时可根据自己的需要选择合适的方法。

（一）mRNA差异显示

mRNA差异显示（differential display，DD）技术又称差异显示反转录PCR（differential display reverse transcription polymerase chain reaction，DDRT-PCR）技术，是目前在筛选和克隆差异表达基因方面最有效的方法。DD技术以分子生物学上最广泛应用的反转录反应，PCR反应和聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础，基本原理是RNA-反转录-PCR。具体步骤见图1-2-3-1。

步骤如下：

首先，含oligo（dT）的寡聚核苷酸为3′锚定引物，与mRNA的poly（A）尾退火，将所有的mRNA反转录成cDNA；并用该引物锚定cDNA第二链的3′端。

然后，用另一随机寡核苷酸引物（5′随机引物）与cDNA第一链互补，进行PCR扩增。由于寡核苷酸随机引物随机结合在cDNA的互补靶位点上，源于不同mRNA的扩增片段大小不同。

将所有产物电泳分离后比较，就可以找到差异条带。回收不同组织所特有的差别条带cDNA，进一步克隆、测序及用于制备杂交或文库筛选的探针，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因。

DD技术的优点：①简单，技术上仅仅依靠PCR和DNA测序胶电泳；②所得到的差别条带往往不止一条，常包含某一基因的上游以及下游的调控基因；③实验周期短，约8天即可完成，便于重复，而且可重复性好；④灵敏度高，可检测出低丰度的mRNA；⑤可以同时在多个材料之间或不同处理材料之间进行比较；⑥可以同时显示多种生物性状的差异及可以同时获得高表达和低表达的基因。

经过多年的实践，DD技术在应用过程中不断得到改进，例如对引物体系的改进，RT-PCR模板的改进，PCR反应参数的优化，凝胶电泳以及标记方法的改进以及杂交方式的改进，同时产生了许多衍生技术如随机引物PCR的指纹法（RAP-PCR）、GDD（genomic DD）、荧光标记差异显示技术（FDD）等，是所有目前在差异基因表达分析中应用的主要技术的“祖先”。

（二）消减杂交

消减杂交（subtractive hybridization，SH）的本质是除去那些普遍共同存在的或是非诱发产生的cDNA序列，使待分离的目的基因序列得到有效的富集，提高分离的敏感性。

经典的消减杂交法是将检测子（tester）mRNA与驱动子（driver）cDNA杂交，或将检测子cDNA与驱动子mRNA杂交，祛除杂交体和未杂交上的驱动子成分（cDNA或mRNA），得到检测子独有的mRNA或cDNA，这些基因即为差异表达基因。

构建减法cDNA文库是mRNA减法杂交中的一个关键环节。减法cDNA文库实际上是一个次级cDNA文库，它富集了所要寻找的特异序列，复杂性降低，不仅便于筛选，而且提高了灵敏度。最初构建这类文库是通过羟基磷灰石柱层析或生物素卵清蛋白体系去除两种材料共有的mRNA，以此来富集差异表达的cDNA。该体系回收的cDNA量少，容易丢失部分mRNA，假阳性高，重复性低。为克服这些问题，人们在方法学上作了一些改进。例如，建立了使用磁珠的减法技术和代表性差别分析技术等。

（三）cDNA的代表性差异分析

cDNA的代表性差异分析（represential display analysis，RDA）是一种以PCR技术为基础的消减杂交技术。其原理是利用巧妙设计的接头和引物，祛除共有序列，驱动子（driver）中没有特异双链cDNA，PCR指数扩增仅在检测子（tester）中存在，从而得到有效富集的差异片段。具体步骤见图1-2-3-2。

首先，用同一种限制性内切酶切割检测子和驱动子的双链cDNA；两端分别接上单链寡聚核苷酸接头，补平后，以接头为引物进行PCR扩增。再用内切酶切除接头，并只在检测子两端接上新接头。随后将检测子与大量驱动子混合杂交，形成三种杂交体：检测子自身杂交体tester/tester，两端都带接头；tester/driver杂交体只有一端带接头；driver/driver杂交体两端都没有接头。然后，补平末端，并以新接头为引物进行PCR扩增。只有tester/tester杂交体的两端均能和引物配对，产物为双链DNA，数量呈指数递增；tester/driver杂交体只能是单引物扩增，产物为单链DNA分子，数量呈线性递增；driver/driver杂交体由于分子两端没有与新引物配对区而无法扩增。差异双链cDNA完成第一轮富集。杂交产物再进行第二轮酶切、加接头、杂交和PCR扩增，重复两次后，可确保从检测子中彻底祛除与驱动子共有的序列。只有差异双链cDNA经PCR几轮循环得以有效富集。

与mRNA DD不同，由于cDNA-RDA进行了不同组织或细胞内表达基因之间的活减杂交，从而大大地减少了mRNA DD中易于出现的假阳性。而且也减少了后续鉴定的工作量。同时，cDNA-RDA具有RDA相同的消减富集和PCR动力学富集的特点、使mRNA DD原本难以显示的稀有mRNA的cDNA得以富集，并获得筛选和克隆。

cDNA-RDA也存在一些局限性，常见问题如下：①由于cDNA从mRNA逆转录而来，因而要求样品必须新鲜，其RNA要有一定的质量保证。导致RNA降解的任何因素都可能造成信息的大量损失；②与基因组DNA相比，cDNA片段要短得多，由此造成限制性内切核酸酶酶切位点分布不均，其消化的结果可能造成cDNA序列两端信息量丢失；③在非酶切位点区域内的点突变、小的缺失或插入难以被发现；④完全无酶切位点的片段无法参与RDA筛选。⑤方法烦琐、费时费力、易于污染。

（四）抑制消减杂交

抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术是依据抑制性PCR发展出来的又一种cDNA消减杂交技术，主要用于分离两种细胞或组织的细胞中的差异表达基因，可以有效克服基因上调表达所造成的不利后果，适用于克隆分析造成某种特殊表型的目的基因及其功能。

首先，将检测子（tester）和驱动子（driver）的双链cDNA酶切，得到平末端cDNA片段。将检测子cDNA均分两份，分别接上接头1和接头2。两接头分别具有一段反向末端重复序列。

然后，将检测子和驱动子进行两轮杂交。先用过量的驱动子分别与两份检测子样品进行杂交，使测试cDNA的单链丰度均等化，以及差异表达的单链分子得到富集。第一轮杂交后，两份杂交产物混合，再与驱动子进行第二轮杂交，进一步富集差异表达的cDNA，并形成两端带有不同接头的双链分子。

最后，杂交产物补平后作为模板，加入根据接头长链序列设计的内、外侧引物，进行两次PCR反应。第一次PCR基于抑制效应，只有两端分别是接头1和接头2的差异表达的序列片段得以指数扩增；第二次PCR极大提高扩增的特异性，使得差异表达的目的基因片段得到大量富集，并可用于后续的筛选工作。

在分离、克隆差异表达的基因序列片段中，抑制性消减杂交技术具有独特的优点。①假阳性率低：这是它最大的优点，抑制性消减杂交技术采用两次消减杂交和两次PCR，保证了较高特异性；②效率高：一次抑制性消减杂交反应可同时分离到几十到几百个差异表达的基因；③简便易行：抑制性消减杂交技术所采用的方法简单、成熟、易掌握、易操作；④高敏感性：cDNA消减杂交、代表性差异分析、mRNA差异显示方法都不能分离到低丰度的差异表达基因，而抑制消减杂交技术显著增加了获得低丰度差异表达的cDNA的概率，对高、低丰度的差异表达基因都能有效分离；⑤筛选周期短：应用抑制性消减杂交技术一般3～4天即可获得差异基因表达片段的cDNA；⑥实验结果复杂程度低：SSH技术由于采用了接头、差减杂交及两轮抑制性PCR扩增，可大量特异扩增那些代表了差异表达的cDNA片段，因而减少了结果的复杂性。

SSH的缺点在于：①每次只能比较两种样品之间基因表达的差异；②SSH依赖较高的RsaI消化效率和接头连接效率，否则不带接头的tester cDNA的杂交方式将和driver cDNA相同，导致一些差异表达的cDNA得不到富集而丢失。同样如果两组tester cDNA与接头的连接效率不同，也将丢失一些差异表达cDNA；有时会产生嵌合cDNA（概率为2%）；③起始材料需要微克（μg）级量的mRNA；SSH差减克隆片段较小，获取cDNA全长序列有一定难度；④SSH技术中所研究材料的差异不宜太大，最好是只有细微差别。

（五）cDNA扩增片段长度多态性

cDNA扩增片段长度多态性（cDNA-amplified fragment length polymorphism，cDNA-AFLP）技术是从基因组AFLP方法发展来的RNA指纹技术，经典的cDNA-AFLP按照标准的AFLP方法进行操作，只不过模板变成了cDNA。这一方法包含3个步骤：①将cDNA酶切并连上载体；②用PCR引物选择性扩增限制性内切酶酶切片段；③电泳及成像。利用该技术可以同时检测多个样本的基因表达差异。具体步骤见图1-2-3-3。

（六）基因表达系列分析

基因表达系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）是一种在转录物水平上研究细胞或组织基因表达模式的快速、有效的技术，也是一种高通量的功能基因组研究方法，它可以同时将不同基因的表达情况进行量化研究。该技术以捕捉和序列分析靠近样品cDNA3′端的一段区域EST（express sequenced tags）为基础，可以快速和详细地分析成千上万个基因，寻找出表达丰富度不同的SAGE标签序列。方法如下：

首先，用生物素标记的Oligo（dT）为3′锚定引物，将mRNA反转录成双链cDNA，限制性内切酶切割，得到多个长250bp左右的片段。然后用连有链亲和素的磁珠将带poly（A）尾的cDNA3′短片段分离出来，每个3′片段代表一个cDNA。把cDNA分成两份，分别连上包含标签内切酶位点的接头A和B，再用标签酶消化，产生单侧平末端cDNA。将两份cDNA混合连接，随机两种分子靠平末端连接，产生两端分别带A和B接头的cDNA连接体，即双标签。这些双标签再被标签酶酶切后，靠其平末端首尾连接串联起来。然后将多标签的串联体一同扩增连入载体，随后对连接物进行测序。具体步骤见图1-2-3-4。

SAGE大大简化和加快了3′端表达序列标签的收集和测序，可以全面地提供生物体基因表达谱信息，还可用来定量比较不同状态下的组织或细胞的所有差异表达基因。但SAGE是一个依赖DNA测序的基因计量方法，覆盖率和灵敏度受限于已测序的大量克隆。同时也极大地依赖高质量的序列，即使单个碱基的序列发生错误或双标签间扩增效率发生微小的变化，都可能导致信息损失或结果失真。

（七）基因芯片技术

基因芯片技术（DNA chip technique）也叫cDNA微阵列杂交技术，是将大量探针分子以预先设计的排列方式固定于支持物上后，与标记的样品cDNA杂交，杂交信号阳性的探针分子就是在组织或细胞中表达的分子片段。若同时将两组生物性状相似但又有不同的组织或细胞cDNAs分别与芯片杂交，芯片上信号分子的分布就会有所不同。

基因芯片由于同时将大量的探针固定于支持物上，因此可一次性对细胞内多种分子进行检测和分析，灵敏度高、重复性好，通过购买商品化的芯片和采用自动化分析技术，使寻找差异基因和功能基因的工作变得简便快速。

当前，差异基因表达分析涉及的技术有很多种，选择时应考虑每种技术所需材料的量、灵敏度、覆盖率和其他实验中用过的试剂、限制酶等。对每个技术平台来说，所要求的生物学材料是一个最基本的考虑因素。此外，要想成功分析基因表达，技术的覆盖率（即用一种技术估计所有可能cDNAs的比例）也是同等重要的。覆盖率决定了要进行几轮重复和几次转录反应。只有分析完整的差异表达基图谱，才能满足全面地描述表达过程或产生特定药物响应图谱的需要。

三、转基因和基因打靶技术

转基因技术是指利用DNA重组技术，将外源性基因转移到细胞内，改造靶细胞的遗传信息，使其在性状、营养和消费品质等方面向预定的目标转变。现在多用来特指制备转基因动物所需的一套技术。

（一）转基因动物技术

转基因动物技术是指通过适当的方法将外源性基因即目的基因整合入特定的载体细胞（如受精卵细胞或胚胎干细胞），然后使之发育成携带外源目的基因的个体，并且可以继续传递给后代。这种技术具有分子及细胞水平上操作而整体表达的特点，从而可以更完整地在整体水平研究目的基因的结构与功能。突出的优越性使转基因动物具有广泛的应用潜能，逐渐成为生命科学研究和开发的重要领域。

转基因动物的制作过程主要有以下几步：目的基因的克隆、改造和载体系统的构建；目的基因向受体细胞转移；含外源基因的受精卵或早期胚胎的发育和表达；验证获得所需的稳定的转基因动物品系。关键是如何将目的基因高效地导入到特定的靶细胞内，并能整合进靶细胞的基因组，并长期表达外源目的基因。

转基因动物技术经过30多年的发展，无论在技术的多样性方面，还是实用性方面都取得了显著进步。外源基因转移方法的发展和完善始终是转基因动物研究的重点之一。显微注射法是指通过显微操作仪把外源基因注入受体动物的受精卵原核，外源基因整合到受体细胞染色体上，发育成转基因动物的技术。这是发展最早、目前使用最为广泛，也是最有效的方法，但存在整合率太低和不能定点整合的问题。外源基因被注入原核，其插入染色体是完全随机的，因而大大影响了外源基因的表达和遗传稳定性。随机整合也可能破坏基本内源基因序列或激活致癌基因，对动物健康产生有害影响。目前较成熟的其他制备方法还有精子载体法、胚胎干细胞法、反转录病毒载体法、电泳冲法、携带外源基因体细胞的核移植法等。在此基础上，基因编辑技术隆重登场，炙手可热的TALEN技术和CRISPER-Cas9技术使得基因编辑更加精准高效，有“生物导弹”之称，为21世纪生物基因工程提供了无限可能，必将在整个生命科学领域大放异彩。

（二）基因打靶技术

基因打靶技术（gene targeting）是近年来发展起来的一项重要的基因定点整合技术。同源重组是基因打靶技术的分子生物学基础。此技术利用基因转移方法，将外源基因导入靶细胞后，通过外源基因序列与靶细胞内染色体上同源DNA序列间的重组，将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某确定的位点，或对某一预先确定的靶位点进行定点突变，从而改变细胞遗传特性。传统的基因敲除主要利用同源重组和随机插入突变进行。

1.传统基因敲除技术

基因打靶主要是在胚胎干细胞水平（embryonic stem ceils，ESC）进行操作。在生物体内，同源重组是普遍存在的一种生理现象，是生物体纠正自身或由外界因素诱导所致DNA突变的一种内在机制。这是基因敲除的分子生物学基础。以此为基础最先发展起来的基因敲除技术有3类，一类是针对原核细胞而开展的，是Red重组系统，利用λ噬菌体基因Red区段编码的一个能够启动细菌染色体与外源DNA发生同源重组；一类是针对真核细胞进行，主要是噬菌体的Cre/Loxp系统和酿酒质粒的FLP/frt系统，均是由一段特殊的DNA序列和一个重组酶来敲除特定基因；一类是大规模的随机插入突变，理论上其也可实现在基因组范围内敲除任一基因。随机插入突变是目前在植物中使用的较为有效的方法之一，主要有转座子和T-DNA插入突变。

基因打靶技术将外源基因定点整合入靶细胞基因组，克服了随机整合的盲目性和危险性，是转基因技术的一大进步。但是，基因打靶针对的基因在胚胎发育过程中或者在成熟生物体内具有至关重要的功能，当这些基因突变后，胚胎往往不能发育至正常分娩，或者出生后由于过于严重的生理缺陷而过早夭亡，或者影响到实验动物的繁殖功能而不能产生后代，进而不能获得携带突变基因的纯合子动物模型，无法开展后续研究。针对上述问题，近年出现了一种特殊的基因敲除或敲入方法，称为条件性基因打靶技术（conditional gene targeting）。条件性基因打靶技术通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。现阶段条件性基因敲除以Cre/Loxp和FLP/frt系统应用最为广泛。

2.新式基因敲除技术

随着技术的发展，目前推出的多种新式基因敲除技术，如RNA干扰（RNA interference，RNAi）、锌指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription Activator-like Effector Nucleases，TALENs）、成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）/Cas9等基因敲除技术及PfAgo基因编辑等，遍及细胞分子生物学、分子遗传学等诸多领域。

（1）利用RNA干扰引起的基因敲除：

RNAi是RNA依赖的基因沉默现象，是双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）分子在mRNA水平上诱发的序列特异性的转录后基因表达沉默。dsRNA在Dicer酶的作用下可产生一系列长度为21～22nt的siRNA（small interference RNA），siRNA 分子、核酸酶以及螺旋酶等结合形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC 以ATP依赖的方式催化双链siRNA解旋，利用RISC内部的单链siRNA，通过碱基配对识别与之互补的靶RNA，切割靶RNA，并由RNA酶降解，从而导致目的基因的沉默。因此，通过将dsRNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其同源的mRNA，封闭内源性基因的表达来失活该基因同样可以实现基因的敲除。

（2）锌指核酸酶基因打靶技术：

ZFNs的核心设计思想是将2个有特定功能的结构域，即特异性识别模块和功能模块融合，形成具有特定功能的蛋白。单个ZFN的DNA结合结构域一般包含3～6个Cys2-His2锌指蛋白重复单位，能特异性识别1个三联体碱基。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当2个识别位点相距6～8bp距离时，2个单体ZFN相互作用产生酶切功能。在此特异位点产生1个DNA双链切口（double strands breaks，DSB），然后利用细胞固有的同源重组或非同源末端连接修复机制进行切口修复，从而达到精确定点修饰的目的。近5年来，研究者已经在果蝇、线虫、植物、两栖类以及培养的人类干细胞中陆续报道了利用ZFNs人为造成特定基因位点的DSB，从而实现高效率的基因定点修饰。ZFN介导的基因敲除技术，可以精确地修饰基因或其周围的调控元件，可为研究人类疾病构建良好的动物模型，通过原核注射或胞质注射获得的基因敲除大鼠、基因敲除兔。存在同源区的外源DNA时，发生同源重组修复，能实现外源基因的定点敲入。

（3）利用TALEN切割特定的核苷酸靶序列引起的基因敲除：

TALENs靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，被认为是基因敲除技术发展的里程碑。TALENs的设计和构建是基于植物病原体黄单胞菌分泌的一种转录激活子样效应因子（Transcription activator-like effector，TALE）可以识别DNA序列的原理。TALE蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核苷酸序列有恒定的对应关系，由34个氨基酸重复序列组成一个单元，重复17～18次，34个氨基酸中的第12和13个氨基酸对应识别1个目标碱基。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块蛋白。TALE蛋白中的DNA结合域与FokI核酸内切酶的切割域融合，在特异的位点打断目标基因，进而在该位点进行DNA操作，如敲入（knock-in）、敲出（knockout）或点突变。

（4）CRISPR/Cas9基因敲除技术：

CRISPR-Cas9基因编辑系统是21世纪最为重要的生物发现之一。2013年《科学》将其评为年度十大突破之一。CRISPR序列最早发现于1987年，2012年Jinek等首次利用Ⅱ型的CRISPR/Cas系统实现了目的DNA特定位点双链断裂，为CRISPR/Cas系统用于基因组定点编辑奠定了基础。它逐渐被证明是一个更为高效快速，简便易行的动物基因敲除新技术。

CRISPR是规律间隔的短回文序列，它是细菌和古细菌所形成的一种适应性强的免疫防御机制，是利用Ⅱ型为CRISPR/Cas免疫系统中的Cas9 DNA切割酶与目标序列互补的向导RNA（single guide RNA，sgRNA）定点切割DNA，从而达到识别和降解外源DNA的目的。CRISPR/Cas9操作简易高效，对多种生物体适用，并可同时对多个靶基因序列或单碱基进行定点编辑，是目前基因改造方面的前沿技术。

随着基因敲除技术的不断完善发展，尤其是CRISPR-Cas9技术的蓬勃发展，加速了对基因功能、干细胞、疾病与基因及疾病之间联系的认识。这使改变基因变得更加容易且在治疗疾病的临床应用方面取得了长足的进步，如治疗残疾的体细胞或预防疾病等。但目前基因编辑技术仍存在一定的挑战：①基因编辑治疗停留在体细胞的治疗及预防阶段，而在残缺的生殖细胞的修饰改造仍需研究；②基因编辑技术大多是应用于体外研究，而体内编辑仍是挑战，如何避免脱靶或高效编辑等；③利用基因组编辑在实践应用方面没有较为可靠的操作经验及试验数据，编辑成功后是否有副作用也值得探讨；④数以千计的基因疾病或需改造的位点都是由单个碱基引起的，因而需要基因编辑不断完善改进，可以精准地对单碱基编辑。

转基因和基因打靶技术为解决目前生物学领域的许多难题提供了新的思路和方法，已广泛应用在改造生物、培育新的生物品种、研究基因结构与功能、表达与调控、研究细胞生活周期调控机制、遗传病的基因治疗等多方面。但是，转基因动物在技术上仍然存在一些问题，需要进一步研究和解决。一是制作转基因动物的效率低，这是限制转基因动物发展的主要因素；二是转基因动物的安全性问题。随着理论上和技术上不断完善，转基因动物在及其相关产品必将会对人们的健康和社会发展产生巨大的影响。

四、反义基因技术

随着基因工程技术的蓬勃发展和代谢调控研究的深入，反义技术应运而生。反义技术的基础是利用DNA或RNA分子与特定靶序列互补结合，通过各种机制使靶序列降解或抑制其编码蛋白的翻译，从而抑制目的基因的表达。

与基因敲除等功能缺失性研究方法相比，反义技术的调控作用温和，不阻断正常代谢通路，对细胞生长和代谢影响较小，还具有投入少、周期短、操作简单等优点。作为一种阻断或封闭特定基因表达的手段，反义技术已经被广泛地研究与应用。

（一）反义分子的类型

1.反义寡聚脱氧核糖核苷酸（oligo-deoxy nucleotide, ODN）

反义ODN分子是指一些单链或双链形式的短小DNA片段。这种反义ODN小分子可以在自然界不同的生物细胞中发现，也可以人工合成，一般人工合成的反义ODN分子的长度不超过30个碱基。反义ODN分子可与细胞内某一特定的基因核苷酸序列互补，因而可以在一定条件下与DNA模板、mRNA模板链以碱基配对的方式结合。反义ODN分子与mRNA分子结合之后形成DNARNA杂种分子（hybrid molecule）；与双链DNA结合，则形成三聚体（triplex）形式的螺旋状DNA结构。反义ODN分子与双链DNA或单链mRNA分子结合之后，对其复制、转录及翻译等过程产生影响，并激活内源性的核糖核酸酶，将其消化破坏。

与自然界中DNA的结构和组成类似的反义ODN分子，称为自然寡聚脱氧核苷酸（natural oligo deoxynucleotide，N-ODN）分子，或称为未修饰型寡聚脱氧核苷酸分子。这种形式的反义ODN分子是最为基本的反义分子形式。当核苷酸中磷酸二酯键结构中的氧原子以硫、甲基、乙基等代替，则分别构成磷酸盐硫化物（S-ODN）、甲基化磷酸盐（M-ODN）、乙基化磷酸盐（E-ODN）等（图1-2-3-5）。各种修饰型的反义ODN分子与N-ODN分子相比，抵抗核酸酶的消化能力大大提高，从而提高了细胞内反义寡聚脱氧核苷酸分子的浓度，延长了反义寡核苷酸的有效作用时间。此外，在反义分子的不同基团上分别连接长链脂肪酸分子，可以增加反义分子的脂溶性，增加其透过细胞膜的能力，加速其进入细胞质、细胞核中，促进了细胞对各种反义分子的摄入能力和转运速率。

2.反义RNA分子（antisense RNA）

DNA是双链螺旋结构，双链方向相反，其中一条链的5′端位于上游，接近启动子的序列，是DNA转录为mRNA的模板，称为DNA的有义链。另一条链，正常情况下不具备转录模板的功能，因为其方向与启动子的转录方向相反，称为DNA的反义链。DNA反义链核苷酸的序列，与此DNA转录而成的mRNA核苷酸序列是一致的。如果将这一段DNA双链，以相反的方向置于启动子的下游，那么两条链的方向正好逆转。正常情况下的有义链，则处于反方向，不能作为转录的模板；相反，正常情况下的反义链，其方向恰好可以使其作为转录的模板。但由反义链转录而来的RNA，其核苷酸序列与mRNA不同，实际上恰好与之互补。这种由DNA的反义链为模板转录而来的、核苷酸序列与mRNA互补的转录产物RNA，即称为反义RNA。

3.核酶分子（ribozyme）

核酶分子是指一类具有酶的催化活性的RNA分子。核酶RNA不仅能够像反义RNA分子那样，以碱基互补的方式与底物RNA分子相结合，而且能够在特定的核苷酸序列部位将底物RNA分子切断，破坏底物RNA分子结构的完整性，因而成为比反义RNA分子更为有效的反义分子。具有酶催化作用的反义RNA分子的发现具有重要的生物学意义，它将酶的概念从蛋白质领域扩展到核酸领域，从而整体改变了对生物界进化的根本看法。因此，核酶的共同发现者Cech和Altman共同获得了1989年的诺贝尔化学奖。

（二）反义分子的作用机制

1.抑制DNA的复制过程

反义ODN分子与靶DNA双链可以形成DNA三聚体形式。这种DNA三聚体形式的存在，严重妨碍了DNA双链半保留复制的机制。因此，反义ODN分子具有抑制DNA复制的作用。

2.抑制DNA的转录过程

反义ODN分子与双链DNA中的启动子序列以Hoogsteen碱基配对的方式进行结合以后，严重阻碍了转录因子激活蛋白与DNA结构中启动子序列的结合，因而启动子不能被正常地激活，也就不会有RNA的正常转录。

3.抑制RNA跨核膜转运过程

反义ODN及反义RNA分子与前体形式的mRNA合成RNA-DNA或RNA-RNA复合物，这类复合物形式难以进行跨核膜转运，仅能滞留在细胞核中。因此，没有足够的mRNA转运到细胞质中，也就没有足够的蛋白质赖以进行翻译的RNA模板，从而干扰甚至阻断了这种基因的表达活动。

4.抑制前体mRNA的剪切过程

RNA的剪切过程需要RNA进行折叠，形成较为复杂的三维立体结构方可进行。反义ODN分子或反义RNA分子能够以Hoogsteen碱基配对方式，在前体mRNA剪切位点附近结合，这样就妨碍了前体mRNA分子立体结构的正确折叠，从而阻碍成熟mRNA的形成过程，进而阻碍蛋白质的翻译过程。

5.抑制mRNA翻译复合体的形成成熟

mRNA的5′-NTR与翻译复合物的形成密切相关。当反义ODN、反义RNA或核酶与mRNA的5′-NTR结合以后，可以非常有效地阻断翻译复合物的形成，从而有效地抑制基因的表达功能。

6.破坏mRNA的结构

无论是何种形式的mRNA，要进行完整的蛋白质分子的翻译，必须保持其结构的完整性。因此，只要从任何一点将其切割，都可以破坏这种mRNA结构的完整性，从而使mRNA作为翻译模板的功能受到破坏。核酶分子可以在mRNA的特定核苷酸序列部位上将其切割、破坏，因而可以阻断基因的表达（图1-2-3-6）。

（三）反义技术的应用

1.反义技术在抗肿瘤中的应用

基因表达水平的异常有两种可能，一种是高于正常水平，另一种是低于正常水平。如果基因表达的水平低于正常情况下基因表达的水平，可以利用基因治疗的技术，导入一种具有正常功能的基因，使这种基因表达的缺陷得到纠正。但是，如果一种基因的表达水平比正常情况下基因表达的水平还要高，如原癌基因、癌基因的激活与过表达，则需要一种技术阻断或降低这类对细胞有害的基因表达。反义分子式一类重要的基因表达调控分子，反义技术在这一领域中具有十分重要的应用前景。

2.反义技术在抗病毒中的应用

病毒感染细胞虽然是致细胞病变的一个原因，但更为重要的是细胞获得病毒的某些基因组，并表达某些病毒的蛋白质，引发机体对这种病毒感染细胞的细胞与体液免疫，从而杀伤病毒感染的细胞。目前虽然从免疫学角度探索了抗病毒治疗的一些方法，但总的来讲还缺乏令人满意的有效性及特异性，因此，抗病毒治疗的探索不得不转移到病毒感染及发病机制的上游环节。例如，从基因水平上，即DNA或RNA水平上探讨抗病毒基因治疗的方法和途径。如果从基因水平上破坏特异性的病毒极影，则可以阻断病毒蛋白的产生，这样就避免了由病毒蛋白引起的免疫病理应答。反义技术就是从这一环节阻断病毒基因表达的一项技术，其不仅是有效的，而且是特异性的。因为反义分子识别和结合病毒基因组的特异性是由碱基配对方式来决定的，因此，这种治疗作用的特异性可有很好的保证。

反义ODN、反义RNA、核酶都曾成功地用于抗病毒基因组表达的治疗研究。自从1998年Zamecnik等应用人工化学合成的13mer的反义ODN分子在体外培养系统中实现了对劳氏肉瘤病毒的复制和表达的阻断以后，化学自动合成的反义ODN大大促进了反义ODN抗病毒治疗的实验研究。此后，对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、单纯疱疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus，HSV-Ⅰ）、人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）、滤泡口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）、水痘带状疱疹病毒（varicella-herpes zoster virus，VZV）、流感病毒等人类主要的致病病毒，都进行了抗病毒治疗试验。其中关于HBV、HCV、HIV的相关研究较多。

五、RNA干扰技术

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是指内源性或外源性的双链（double-stranded RNA，dsRNA），在细胞内特异地降解与之互补的靶基因mRNA，从而致使特异性基因有效封闭的过程。由于发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）。

RNA干扰现象普遍存在于真核生物中，行使基因调控和抵御外源片段侵袭的作用。在多种生物中，外源双链RNA导入细胞中，与dsRNA同源的mRNA会被降解，能够比反义RNA或正义RNA更有效地关闭基因的表达。RNA干扰作为一种简单有效的代替基因敲除的遗传工具，为抑制基因表达提供了高效、特异性的手段，而且为基因功能研究、基因治疗研究等提供了重要的技术方法。RNAi发现及发展进程见图1-2-3-7。

（一）RNAi的作用机制

干扰性小RNA（small interfering RNA或short interfering RNA，siRNA）是RNAi赖以发生的重要中间效应分子。siRNA是一类长约21～25bp的特殊dsRNA分子，具有特征性结构，即siRNA的序列与所作用的靶mRNA序列具有同源性；siRNA两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基；每条单链的3′端均有2～3个突出的非配对碱基，通常为UU。

从dsRNA引发RNAi的发生大致划分为以下三个阶段，即起始阶段（启动）、效应阶段（剪切）和RNAi信号放大阶段（扩增）（图 1-2-3-8）。RNAi过程涉及的蛋白质见图1-2-3-9。

1.起始阶段

首先，长链的引发dsRNA在内切核酸酶Dicer作用下降解为多个siRNA，随后，siRNA整合入RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）。

2.效应阶段

RISC发挥催化活性，靶定并切割多个mRNA分子，从而达到干扰基因表达的作用。

3.RNAi信号放大阶段

siRNA可作为一种特殊的引物，在RNA聚合酶作用下，以靶mRNA为模板重新合成dsRNA，然后通过Dicer降解成新的siRNA。新生成的siRNA又可进入上述循环。新生的dsRNA反复合成和降解，不断产生新的siRNA，从而使靶mRNA渐进性减少，呈现基因沉默现象。这种在RNAi过程中对靶mRNA的特异性扩增作用有助于增强RNAi的特异性基因监视功能。每个细胞只需要少量dsRNA即能完全关闭相应基因表达。

（二）RNAi的作用特点

1.RNAi作用具有高度序列特异性

这是RNAi的最大特点。siRNA与靶序列之间单一碱基的错误，都可能降低RNAi的效率。这种高度序列特异性使得RNAi能选择性地降低带有点突变、插入、缺失的等位基因的表达。因此，可以利用RNAi技术对目标基因进行特异性地表达沉默，通过观察其表达被抑制后细胞以至生物体从形态到各项生理生化的变化，对该基因的功能及参与的信号网络进行研究。

2.RNAi作用具有高效性

传统的基因敲除和反义RNA技术存在周期长、不能大规模同步进行等缺点。基因敲除技术还造成基因功能永久性缺失，某些基因的敲除常导致个体在发育早期死亡使研究无法继续。反义RNA技术的抑制作用较弱，经常产生过渡型的表型，大大妨碍了对目标基因功能的正确判断。相比之下，RNAi技术具有多方面的优势。它比反义RNA技术更有效，更容易产生基因的功能丧失或降低，而且通过与细胞异性启动子及可诱导系统结合使用，可以在发育的不同时期或不同器官中有选择地消除或减少特异基因的活性。

3.RNAi作用具有高度稳定性

以3′端悬垂TT碱基的双链RNA尤为稳定，无需像反义核酸那样进行广泛的化学修饰以提高半衰期。

4.RNAi作用具有特殊的穿透力

dsRNA可以穿透细胞障碍而在不同细胞间远距离发挥作用。如将dsRNA注射到线虫性腺中，其会干扰性腺以外的其他体细胞的基因表达。此外，RNAi还可以传递到F1代，但F2代又恢复野生型。

5.RNAi作用的靶序列具有选择性

根据不同目的基因结构设计的dsRNA所产生的效应存在显著差异。一般认为外显子区的dsRNA能够起作用，而内含子和启动子序列区无效。保守基因对RNAi敏感，神经细胞对RNAi不敏感，参与精子运动的基因也很少能够发生RNAi效应。

6.RNAi作用受dsRNA长度影响

在线虫、果蝇的研究表明较长的dsRNA阻抑效应更强一些，一般大于100bp。哺乳动物中，大于30bp的dsRNA引起阻抑效应广泛且具非特异性，而3′端有对称性突出2bp（21～23bp）的siRNA引起的阻抑效应具有很高的特异性。

由于其高度序列特异性和高效性等特点，RNAi技术已成为一种理想的细胞水平基因敲除工具，在生物技术和生物医学领域具有巨大的发展潜力和广泛的应用前景。目前，RNAi技术在分子传递途径、组织靶向性及安全性等方面还有待进一步研究。相信随着RNA机制的逐渐阐明，RNAi技术的更加完善，必将大大推进基因功能的研究，更为各种病毒性疾病的根治开辟新的治疗途径。

（三）RNAi的应用

1.RNAi在基因功能研究中的应用

随着人类基因组计划的提前完成，基因组学的重心已由结构基因组学转向功能基因组学，科学家急需一种新的、快速的方法解读基因的功能和基因的表达机制以及基因之间的相互关系。RNAi通过特异性地抑制基因的表达来阐明基因在生物体中的功能，较传统方法有其独特的优点：①简单易行，容易开展；②与基因敲除相比实验周期短、成本低；③与反义技术相比具有高度特异性和高效性；④可进行高通量基因功能分析。RNAi技术的诸多优点使它很快便被作为研究基因功能的主要方法（图1-2-3-10）。例如，Harbth等应用RNAi技术发现有13个基因对哺乳动物培养细胞的生长和分化必不可少；Maeda等利用高通量RNAi技术对线虫的10 000多个基因进行了功能分析，取得了理想的效果。总之，随着后基因组学时代的到来，RNAi技术将会成为功能基因组学研究的主要方法。

2.RNAi在基因治疗中的应用

（1）RNAi与肿瘤：

肿瘤是由多个基因相互作用的基因网络调控异常的结果，如果只针对单个突变基因进行基因治疗，效果并不理想。而同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列，RNAi可以利用这一特性设计相对应的siRNA，使多个基因同时沉默。目前RNAi在肿瘤基因治疗中的应用主要集中在与肿瘤发生、转移相关基因（如癌基因、抑癌基因、肿瘤转移相关基因），以及与肿瘤耐药、细胞凋亡、信号传导、有丝分裂、肿瘤血管生长等一系列有关的基因方面。已经有很多学者发现了肿瘤发生发展的分子靶点，对其进行RNAi介导的特异性基因沉默技术可以起到治疗的作用。例如，Buduru等人总结了口腔癌中RNAi作用的分子靶点，包括与细胞增殖相关的Pa28α、Sox4、Angptl4，与炎症相关的IL-8，与侵袭转移相关的Sox4、Ang2、Angptl4、Wnt、Ctsb、Slug、Ck14、Has2、Versican、Frmd4A、Cxcr4、Cip2A，与血管生成相关的VEGF、Angptl4、Ang2，与多药耐药相关的 Mdr1、Mdr2，与细胞吞噬作用相关的Cd47，与肿瘤生长相关的Cip2A、Frmd4A，与热休克反应相关的Bag3等（图1-2-3-11）。RNAi有可能在三个方面影响肿瘤研究：①人们已经越来越清楚转录后基因沉默机制的破坏会直接影响肿瘤研究；②RNAi已经被用来辅助研究与肿瘤发生、发展、治疗期间的反应和扩散等方面相关基因的功能，不经增加了对肿瘤发生发展机制的了解，而且有助于鉴定新的有效治疗靶点；③siRNA本身有可能成为一种具有治疗效果的药物。

在肿瘤的基因治疗策略中，RNAi具有如下优势：①RNAi基因抑制效果确切，应用微量siRNA即可使其编码致病基因产物含量下降90%以上，甚至可达到基因敲除的效果；②RNAi的抑制具有严格的序列特异性，治疗针对性强，应用此技术能够同时抑制多个基因而互不干扰；③RNAi的作用具有级联放大效应和高穿透性，因而更适合恶性肿瘤的实验研究；④RNAi序列识别的特异性也可以对野生型点突变形成的癌基因产生准确有效的封闭效果，而对野生型基因则无影响。已有研究发现，针对白血病相关基因的siRNA能够明显促进白血病细胞的凋亡，并能够提高细胞对化疗的敏感性，显示出良好的治疗作用；针对肿瘤重要靶标VEGF不同异构体的dsRNA，可特异性封闭大分子质量VEGF的表达而有效抑制肿瘤的生长。因此，通过RNAi介导的特异性基因沉默技术可作为一种新的肿瘤治疗方法，具有光明的临床应用前景。

（2）RNAi与病毒：

病毒具有多个家族，彼此存在很大差异，但所有病毒蛋白的表达均依赖于病毒编码的mRNA翻译。RNAi技术的发展和应用为抗病毒治疗提供了一种高效、方便的方法，所有病毒在一定程度上都可受siRNA特异性的靶向降解mRNA作用的影响。RNAi在病毒性疾病中的应用，最广泛使用的方法为直接靶向抑制病毒蛋白在宿主细胞中的表达和复制，此外，还能以病毒赖以进入宿主细胞的病毒受体作为靶标而抑制病毒感染细胞。因此，针对病毒基因组RNA的siRNA和针对宿主细胞病毒受体的siRNA均具有抗病毒作用，RNAi有望在抑制病毒复制、切断病毒感染途径等方面发挥作用。

目前RNAi在人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、呼吸道合胞病毒（respiratory syncy-tial virus，RSV）、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、SARS、登革热病毒、口蹄疫病毒等诸多危害人体的病毒研究中均取得了可喜成果。已有研究报道，RNAi技术能够抑制体外培养细胞中HBV、HCV、HPV、HIV、流感病毒等病毒基因在宿主细胞内表达或复制。这表明在未来的病毒性疾病防治中，RNAi技术将可发挥举足轻重的作用。

3.RNAi在药物研发中的应用

随着耐药菌的日益增多、各种疾病发病机制的阐明，传统的化学合成药物、微生物筛选等常规方法已无法满足临床需要，有针对性的新药开发途径成为一个研究热点。RNAi可以特异高效地抑制基因表达，获得去基因功能表型，能够在短时间内大规模筛选和评定靶点，大大缩短了药物研发时间。有研究者通过RNAi技术减少蛋白转移酶9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）的表达，发现小鼠血清胆固醇水平显著减低，说明沉默PCSK9可成为治疗高胆固醇的药物靶点。总之，RNAi技术作为寻找新的药物靶点的工具，不仅可以快速、大规模、高通量地对发现的药物靶基因进行功能分析，同时，基因药物还具有序列特异性高和不良反应小的优势，能够为未来的药物研发提供新思路和新途径。

六、Micro RNA技术

微小RNA（microRNA，miRNA）是一个不编码蛋白质的单链小分子RNA家族，由具有局部发夹结构的内源性转录产物衍生而来，长度约19～25nt，通过碱基配对与靶mRNA结合，从而在转录后水平引起靶mRNA的剪切或是翻译的抑制。miRNA广泛存在于真核生物中，目前，已经从各种生物中发现了数千种miRNA，其数量相当于每一物种中蛋白编码基因的1%～4%。根据预测，人体约30%以上的基因都受到miRNA的调控。

miRNA基因家族具有高度保守性，表达上具有组织和时序特异性，以自身特有的方式调控其他功能基因的表达，在生物的生长发育、疾病发生过程中发挥着重要作用。全面而深入地剖析miRNA的发生、作用机制和功能，不仅有助于揭示生物发育机制和一些疾病的发病机制，为疾病治疗确定新的分子靶标，而且能为miRNA基因疗法提供理论基础。

（一）miRNA的作用机制

1.miRNA的网络式调控机制

miRNA本身不具有ORF，因此不编码蛋白质，但其可以通过复杂的调控网络启动或参与多种调节途径。研究显示，miRNA与靶基因之间的关系基本遵循“一对多和多对一”的模式，即一个miRNA可以识别多个靶基因，而几个miRNA也可以共同调节同一靶基因。这种调节关系使得miRNA与靶基因之间形成了复杂、精细和广泛的调控网络。据估计，人类基因近1/3受到miRNA的调节。

2.miRNA的三种作用模式

miRNA是一类高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分为三大类。第一类以线虫lin-4为代表，是目前发现最多的种类，它们能够与靶基因不完全互补，因此不能改变mRNA的水平，但可以抑制靶基因翻译。第二类以miR-39和miR-171为代表，它们可以与靶基因完全互补结合，并可切割靶mRNA，其作用方式和功能与siRNA非常相似。第三类以let-7为代表，它兼具以上两种作用模式，当与靶基因完全互补结合时，直接靶向切割mRNA；当与靶基因不完全互补结合时，则抑制基因翻译水平。此外，人们还发现，let-7还可以通过脱腺苷化将mRNA上poly A尾巴脱去，造成了目标mRNA整个片段的降解，导致基因无法表达，这也可能是其作用的一种新机制（图1-2-3-12）。

（二）miRNA和siRNA的区别和联系

siRNA为RNAi研究的核心，而miRNA与siRNA紧密相联。miRNA和siRNA间存在许多共同点，但也存在诸多差异（图1-2-3-13）。

1.共同点

①片段长度：成熟miRNA和siRNA均由约22个核苷酸组成；②生成过程：Dicer酶为关键酶；③功能阶段：二者功能发挥依赖于RISC复合体的参与；④作用层次：二者均在转录后水平发挥作用。

2.不同点

①来源不同：miRNA由细胞自身产生，为内源性；siRNA为外源性分子，通常由病毒感染或人工引入；②成熟过程：siRNA一般由外源性长链的dsRNA经Dicer-2和R2D2蛋白作用切割形成，而且每个前体dsRNA能够被切割成不定数量的siRNA片段；③功能阶段：siRNA与RISC结合后通过与序列互补的靶标mRNA编码区完全结合，从而降解mRNA以达到抑制蛋白质翻译的目的。

（三）miRNA基因鉴定和确认

由于miRNA具有非常重要的调控功能，因此寻找新的miRNA成为生物领域的一大热点。现在已知的miRNA多是通过基因克隆和生物信息学筛选的方法发现的。

1．基因克隆法即从总RNA中富集大约22nt的小RNA分子，制备一个小RNA文库。将文库中的小RNA序列与基因组数据库中BLAST比对，排除非miRNA序列后，通过Northern印迹得到最终确认。目前大量的已知miRNA都是通过这种方法获得的。

2．由于miRNA的时空特异表达性，以及常规克隆方法只能克隆出较高量表达的miRNA，生物信息学预测方法开始被广泛用来在各物种中鉴定新的miRNA。它主要依据pre-miRNA的茎环结构和miRNA序列在进化过程和物种间的保守性来进行。根据目前已知的miRNA基因序列总结它们的特征和规律，编写计算机程序，通过对生物基因组数据库进行搜索，可以找到那些可能为miRNA的基因序列，然后通过Northern blotting来筛选真正的miRNA基因。目前两个最主要的miRNA基因预测工具分别为MIRscan和miRseeker，前者已经成功地应用于脊椎动物和线虫，而后者则成功地应用于昆虫。随着生物信息学的发展和生物全基因组测序的完成，生物信息学分析逐渐成为研究miRNA的主要方法。

要确认基因克隆获得的或生物信息学分析预测的基因是否为真正的miRNA，必须以下列几个原则作为判断标准：①能够通过与特定大小的总RNA样品杂交得到22nt的产物，即需要Northern杂交或引物延伸反应验证表达；②所得的序列是从特定大小的22nt的小分子RNA库中克隆到的，并且必须与克隆的来源物种的基因组序列完全匹配；③经过前体的二级结构预测，有发夹状的二级结构，并且成熟的miRNA序列在发夹的一条臂上；④成熟的miRNA序列与预测的二级结构在不同物种间有保守性；⑤在Dicer突变的系统中，前体的积累增多。

（四）miRNA功能研究和靶标基因的鉴定

随着miRNA在不同生物中的大量发现，对miRNA功能的研究也越来越引起人们的重视。目前，仅有线虫lin-4、let-7和果蝇bantam等少数几个miRNA的功能及靶基因比较明确，其他大多数miRNA的功能研究还停留于初级阶段。研究miRNA功能的一个重要方法是通过体内实验，在miRNA基因或miRNA的靶位点上引入突变，也可以将miRNA进行异位表达或是通过转基因的方法，导入特定的miRNA，然后根据表型的变化对功能做出推断。

相对于miRNA的发现速度，应用体内实验的方法研究miRNA的功能显得相当费时费力。利用表达谱分析和生物信息学方法预测靶基因成为当前miRNA研究的热点。通过预测靶基因，根据靶基因已知的功能也可进一步推测出miRNA的功能线索，从而为全面了解miRNA在细胞中的功能打下基础。同时计算机预测靶基因后，还需进一步实验验证来确认靶基因的真实性。

（五）miRNA的应用

1.miRNA在肿瘤诊断中的应用

生物标志物是一类能被用来指示正常与病态过程的客观上可测量的生物特征分子。miRNA参与细胞的增殖、分化、凋亡、胚胎发育、生物代谢等过程，从而影响生物个体在细胞、组织或整体水平上的生长和发育，进而参与多种疾病的发生与发展（图1-2-3-14）；此外，miRNA稳定性好，不容易被RNA酶分解，并且耐受极端的生理环境。多项研究已发现，miRNA在消化道肿瘤、乳腺癌等癌症中具有作为生物标志物的潜能。

2.miRNA在疾病治疗中的应用

（1）miRNA与肿瘤：

研究发现，miRNA表达水平改变是人类肿瘤普遍现象之一。大约50%得到注解的miRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点（fragile site），且不断有肿瘤发生与miRNAs的表达异常的例子报道。总的看来，miRNA可能利用其与靶基因之间的网络状调控机制发挥了类似原癌基因和抑癌基因的作用。miRNA主要通过转录后抑制作用调控靶基因表达水平，若miRNA的靶基因是癌基因，miRNA表达下调，则意味着它对癌基因的抑制作用减小，引起癌基因编码的蛋白质增加；反之，若miRNA的靶基因是抑癌基因，miRNA表达高于正常水平，则意味着它对抑癌基因的抑制作用增加，引起抑癌基因编码的蛋白质减少（图1-2-3-15）。其他与肿瘤发生、发展相关的转移相关基因和耐药相关基因与miRNA的关系也大致如上所述。有研究者开发了一种基因微矩阵芯片，在这种芯片点上已知的人类和小鼠的所有miRNAs基因，结果发现每一种组织都有其独特的miRNAs表达模式。这项工作有助于研究人员更好地了解miRNAs与肿瘤的相互关系并为新药的开发提供靶标。

由于部分miRNAs过表达具有原癌基因特性，所以通过引入与其互补的抗miRNA寡聚核苷酸（antimiRNA oligonucleotides，AMOs），可能有效地灭活肿瘤细胞中的这类miRNAs，抑制肿瘤细胞生长。例如，使用antagomirs（与胆固醇偶联的AMOs）注射小鼠后可以在不同器官有效抑制miR-16、miR-122、miR-192和miR-194的活性，因此，antagomirs有望成为一种治疗肿瘤的药物。临床上，可以通过持续的使用2′-O-甲基化或锁定核酸等修饰的AMOs给药使miRNA失活，这些修饰的目的是使得AMOs更加稳定，且比其他治疗手段毒性更低。另一方面，过表达具有肿瘤抑制基因作用的miRNAs，如利用病毒或脂质体的表达系统瞬时引入大量具有抑癌基因特性的miRNAs也是一种较为理想的治疗手段。例如，有研究者将在肝癌细胞中低表达但在正常组织中高表达的miR-26a基因通过病毒转到肝癌小鼠的体内，发现肿瘤细胞发生增殖抑制或者凋亡。这些研究都为肿瘤治疗提供了新的思路和理论依据。

（2）miRNA与病毒：

人体内存在着大量的miRNA，在机体被病毒入侵时，这些miRNA能调节病毒生命周期和宿主细胞内的复制转录过程，在病毒和宿主相互作用中发挥着重要作用。miRNA介导的RNA干扰提供了一种新型的抗病毒策略，已应用到非典病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒等多种病毒的临床试验中。同时，miRNA对疫苗生产也能发挥重要的作用，进一步帮助人类战胜病毒性感染等疾病。有研究者利用miRNA沉默技术作为弱化疫苗毒性的一种新方法。他们将miRNA反应原件掺入到H1N1和H5N1病毒核蛋白质的开放性读码框中，通过miRNA介导基因沉默可以弱化病毒活性，产生H1N1和H5N1减毒活疫苗的重配株，随后的实验证明此方法在弱化疫苗毒性方面优于传统方法，且安全性增高，适应年龄群广。

七、系统生物学技术

20世纪生物学经历了由宏观到微观的发展过程，由形态、表型的描述逐步分解、细化到生物体的各种分子及其功能的研究。1990年启动的人类基因组计划又是生物学发展的一个转折点，在人类基因组计划带动下出现的一系列组学，逐步把分子生物学时代推向系统生物学时代。

系统生物学是在细胞、组织、器官或生物体整体水平，研究一个生物系统中所有组成成分（基因、mRNA、蛋白质等）的构成，以及在特定条件下这些组分间的相互关系，并通过计算生物学类定量描述和预测生物功能、表型和行为的学科。也就是说，系统生物学要研究所有的基因、所有的蛋白质、组分间的所有相互关系。显然，系统生物学是以整体性研究为特征的一种大科学，是生命科学研究领域的一门新兴学科。

系统生物学的基本工作流程有这样四个步骤。首先是对选定的某一生物系统的所有组分进行了解和确定，描绘出该系统的结构，包括基因相互作用网络和代谢途径，以及细胞内和细胞间的作用机制，以此构造出一个初步的系统模型。第二步是系统地改变被研究对象的内部组成成分（如基因突变）或外部生长条件，然后观测在这些情况下系统组分或结构所发生的相应变化，包括基因表达、蛋白质表达和相互作用、代谢途径等的变化，并把得到的有关信息进行整合。第三步是把通过实验得到的数据与根据模型预测的情况进行比较，并对初始模型进行修订。第四步是根据修正后模型的预测或假设，设定和实施新的变化系统状态的实验，重复第二步和第三步，不断地通过实验数据对模型进行修订和精炼。系统生物学的目标就是要得到一个理想的模型，使其理论预测能够反映出生物系统的真实性。

系统生物学要把系统内不同性质的构成要素（基因、mRNA、蛋白质、生物小分子等）整合在一起进行研究。对于多细胞生物而言，系统生物学要实现从基因到细胞、到组织、到个体的各个层次的整合。如何通过研究和整合去发现和理解涌现的系统性质，是系统生物学面临的一个根本性的挑战。系统生物学还是典型的多学科交叉研究，它需要生命科学、信息科学、数学、计算机科学等各种学科的共同参与并合作。

系统生物学使得生物学研究发生结构性变化。长期以来，生物学研究都是在规模较小的实验室进行的，系统生物学研究将由各种组学组成的大科学工程和小型生物学实验室有机结合。系统生物学研究也将在更大范围和更高层次进行学科交叉和国际合作，如人类基因组计划、人类单体型图谱计划、人类表观基因组学计划等。

系统生物学的发展将带动其他学科和生物学分支学科的发展。在数学方面，有望开发新的数学方法以探索大型生物数据集中的信息结构。在神经科学方面，系统生物学将以多种方式影响神经科学，几种生物的神经元电生理学研究已经开始识别生物体所使用的神经元类别，以了解它所居住的空间中的位置以及它何时移动到新的空间。在微生物研究方面，通过系统生物学，开始探索宿主及其寄生虫的生命周期和进化，微生物组和宿主免疫系统、神经系统之间的通信方式，神经系统、免疫系统中的激素和细胞因子通信如何协调对正常、病理过程的反应等。

系统生物学使生命科学由描述式的科学转变为定量描述和预测科学，不仅是生命科学理论的重大发展，而且逐步在预防医学和个性化精准诊疗中得到应用。系统生物学将不仅推动生命科学和生物技术的发展，而且对整个国民经济、社会和人类本身产生重大和深远的影响。

（王培军　倪　炯　夏　伟　许　云）