二、细菌分离、培养、鉴定和药敏试验

猪的细菌性疾病种类很多，危害大。有的易于诊断（如仔猪黄痢、白痢等），有些疾病难以确诊（如副伤寒、猪接触传染性胸膜炎、肺炎等），而更多的细菌病是并发、继发混合感染，为了及时、准确地诊断，必须进行细菌的分离、培养和鉴定，同时还可将分离出的细菌株，通过抑菌试验筛选出敏感性强、疗效好的抗菌药物进行治疗。细菌学的检查内容主要包括病料的采集，细菌的分离培养，形态观察，生化试验和动物接种试验等。

（一）采样与病原分离

1.病料采取

生前无菌采取血液、水肿液、未被污染的分泌物（鼻液、尿液、粪便等），死后采取心血、肝、脾、淋巴结、骨髓或肺部病灶等。

2.病料处理

脏器或淋巴结应先做表面除杂，将组织块浸渍于95%酒精中并立即取出，引火自燃，这样反复2～3次，或在沸水中浸烫数秒钟，然后用灭菌刀剖切，将剖面做几个触片，并用接种针涂抹开，以提高检出率。

3.直接镜检

将血液、水肿液等涂的玻片或其他脏器剖面做的涂片，部分用甲醇固定做革兰氏染色，部分瑞氏或美蓝染色，进行显微镜检查。

4.分离培养

将上述镜检的可疑细菌，用鉴别培养基分离培养24小时后，再涂片染色镜检，再进一步做生化和动物接种试验。

（二）病原的鉴定

1.生化鉴定

对上述分离培养获得的细菌进行葡萄糖、果糖、单奶糖、蔗糖和甘露醇等分解试验，甲基红（MR）试验和维培二氏（VP）试验、石蕊试验、明胶试验等。

2.动物接种试验

取病料在灭菌研钵中加生理盐水1∶10制成乳剂，皮下或腹腔接种小白鼠，观察小白鼠的状况，对死亡的小白鼠进行剖解，取病料涂片染色镜检。

3.血清型鉴定

有些细菌有分型的，还需要进行血清型的鉴定。

（三）药敏试验

由于各种病原菌对抗菌药物敏感性不同，而且细菌的耐药性也越来越明显。因此，测定可疑菌株对抗菌药物的敏感性，选用有效的抗菌药物是提高治疗效果的必要措施。常用的药物敏感试验方法有纸片法、试管法等。

1.纸片法

本法简单易行，出结果快，应用也最普遍。

（1）抗菌药物纸片的制备

① 灭菌滤纸片准备　将质量较好的定性滤纸用打孔机打成直径6mm的圆形小纸片。每100片放入一小瓶中，瓶口用牛皮纸包扎，160℃干热灭菌1～2小时，或高压灭菌30分钟后在60℃下干燥备用。

② 药物纸片制备、保存　用无菌操作法将待测定的抗菌药物溶液（抗生素药物的浓度一般为青霉素200IU/mL，其他抗菌素1000μg/mL，磺胺类药物10mg/mL，中草药制剂1克/毫升）1mL加入100片纸片中，置冰箱内浸泡1～2小时，如立即试验可不烘干，若保存备用可用培养皿烘干法或真空抽干法干燥。

培养皿烘干法是将浸有抗菌药液的纸片摊平在培养皿中，37℃温箱内保存2～3小时即可干燥，或放在无菌室内过夜干燥。真空抽干法是将放有抗菌药物纸片的试管，放在干燥器内，用真空抽气机抽干，一般需要18～24小时。将制好的各种药片装入无菌小瓶中，置冰箱内保存备用。干燥的抗菌药物纸片可保存6个月。当用标准敏感菌株做敏感性试验，记录抑菌圈的直径，若抑菌圈比原来的缩小，则表明该抗菌药物已失效，不能再用。

（2）培养基和菌液　一般细菌如肠道杆菌及葡萄球菌等可用普通琼脂平板；链球菌、巴氏杆菌或肺炎球菌等可用血液琼脂平板；测定对磺胺类药物的敏感试验时，应使用无蛋白胨脂平板。菌液一般为培养10～18小时的幼龄菌液。

（3）试验方法　用接种针取培养10～18小时的幼龄菌，均匀涂抹于琼脂平板上，待干燥后，用镊子夹取各种抗菌纸片，平均分布于琼脂表面，纸片间距不小于40mm，在37℃温箱内培养18小时后观察结果。

（4）结果判定　根据抗菌药物纸片周围无菌区（抑菌圈的直径）的大小，判定其耐药程度。

2.试管法

是将药物做倍比稀释，观察不同浓度的药物对细菌的抑制能力，以判定细菌对药物的敏感度。常用于测定抗生素及中草药对细菌的抑制能力。

（1）试验方法　取无菌试管10支，排列于试管架上，在第一管中加入营养肉汤培养基1.9mL，其余9管加入1mL。吸取配制好的药液原液0.1mL，加入第一管中，充分混匀后吸出1mL移入第二管中，混匀，再从第二管吸取1mL加入到第三管，依此法直至第九管中，吸出1mL弃去。第十管不加药液作对照。然后向各管中加入幼龄菌稀释液50微升（培养18小时的菌液做1∶1000稀释，培养10小时的菌液做1∶10稀释），于37℃温箱中培养18～24小时后观察结果。

（2）结果判定　培养18小时后，凡无细菌生长的药物最高稀释倍数即为该菌对药物的敏感度。如由于加入药物使培养基变混浊，眼观不易判断时，可进行接种培养或涂片染色镜检判定结果。