三、血清学检查

抗原和相应的抗体在动物体内或体外都能发生特异性结合反应，这种反应称为抗原抗体反应。习惯上把体内的抗原抗体反应称为免疫反应，体外的抗原抗体反应称为血清学反应。

血清学检查可以用已知的抗体检查未知的抗原，也可用已知的抗原测定未知的抗体。由于血清学反应具有高度的特异性和敏感性，因此，在兽医学上广泛用于许多传染病的诊断、病原微生物的鉴定及抗体的检测等。

目前，已知的血清学诊断方法很多，随着科学技术的进步，新方法、新技术还在不断地出现。下面介绍几种猪场通过学习都能掌握和使用的诊断方法以及一些有应用前景的新型技术：凝集试验、沉淀试验、病毒中和试验、免疫酶技术、免疫胶体金技术、固相免疫吸附凝集技术、脂质体免疫测定法、单克隆抗体技术、反转录聚合酶链式反应和免疫荧光试验等。

（一）凝集试验

其原理是：颗粒性抗原（红细胞、细菌、病毒等）与含有相应抗体的血清混合，在电解质的参与下，能发生特异性结合，形成抗原-抗体复合物，这种复合物呈均匀状态悬浮于液体中，这时肉眼看不见，当抗原抗体复合物在一定浓度的电解质作用下，复合物表面的电荷大部分被消除，失去了互相排斥的作用，复合物之间互相吸引，凝集成团，出现肉眼可见的凝集现象。作用于凝集反应的抗原，称为凝集原；与之相结合的抗体，称为凝集素。

凝集反应按原理可分为直接凝集反应和间接凝集反应两类。猪病诊断中的常用的方法有以下几种。

1.全血玻片凝集试验

在实践中主要用于细菌性疾病的抗体检测和抗原（经分离培养后）的鉴定。

2.试管凝集试验

这是一种定量法，用于测定被检血清或其他体液中有否某种抗体及其效价，可作临床的辅助诊断，或用于流行病学监测。在猪场中，本法常用于猪布氏杆菌病的诊断。

3.间接红细胞凝集试验

其原理是：将抗原（或抗体）吸附在比其体积大千万倍的红细胞表面，只需少量的抗体（或抗原），就可使这种致敏的红细胞通过抗原和抗体结合，出现肉眼清晰可见的凝集现象。这种试验能大大提高反应的敏感性。用抗体致敏红细胞检测相应的抗原，称为反向间接血凝试验；反之，称为正向间接血凝试验。在猪病的诊断中，常采用本法鉴定猪口蹄疫、水疱病、猪瘟、传染性胸膜肺炎等疾病的抗原，或检测其抗体。

4.乳胶凝集试验

主要用于猪伪狂犬病和萎缩性鼻炎的诊断，是用其病毒致敏乳胶抗原来检测被检猪的血清、全血或乳汁中的抗体。具有简便、快速、特异、敏感的优点。

（二）沉淀试验

原理是：利用可溶性抗原（如细菌的培养滤液、病毒的可溶性抗原等）与相应的抗体结合，在电解质存在时，可形成肉眼可见的白色沉淀物。参加沉淀反应的抗原，称为沉淀原，抗体叫做沉淀素。沉淀试验的具体方法有多种，如琼脂扩散试验、环状沉淀试验和免疫电泳等。

琼脂扩散试验是目前诊断猪病最常用的方法。本法可用已知抗原测定未知抗体，反之亦然。在猪病的实验室诊断中，常用于猪伪狂犬病的抗体检测，也有用来检查猪瘟、猪水疱病等的抗原。

（三）病毒中和试验（VNT）

病毒与相应抗体结合后，使病毒不能吸附或穿入易感细胞，丧失了破坏细胞的能力从而抑制细胞病变的产生，借此定量测定病毒或其抗体的效价。用病毒中和试验定量检测抗体是经常使用的血清学方法。应用已知抗血清，也可很好地鉴定未知病毒和区分不同血清型的病毒。

（四）免疫酶技术

免疫酶技术是根据抗原与抗体特异性结合的功能，以酶作标记物，利用酶对底物具有高效催化作用的原理而设计的。它是通过化学方法将酶与抗体（或抗原）结合起来，标记后的抗体（或抗原）仍然保持与相应抗原（或抗体）相结合的免疫学活性，形成酶标抗体-抗原（或酶标抗原-抗体）复合物。复合物中的酶在遇到相应的底物时，催化底物分解、氧化而生成有色物质，根据有色产物的有无及其浓度，可间接推断被检抗原或抗体是否存在及其数量，达到定性和定量检测的目的。

免疫酶技术既可用于抗原的诊断，也可进行血清抗体的检测。已经广泛地用于传染性疾病的诊断、血清流行病学调查和抗体水平的评价、微生物抗原的检测及其在感染细胞内的定位。目前对猪瘟、伪狂犬病、繁殖与呼吸综合征、流行性腹泻、旋毛虫病、猪气喘病等疾病均采用免疫酶技术进行病原诊断、抗体检测和血清学流行病调查，并且已成为规模化猪场化验室工作的一项重要内容。利用免疫酶技术测定抗原或抗体的方法很多，下面简要介绍几种适合猪场使用的免疫酶技术。

1.酶联免疫吸附试验

是固相免疫酶测定法中应用最广泛的一种测定方法，以物理吸附法制备免疫吸附剂。按检测目的和操作步骤不同，常用间接法和双抗体夹心法，前者常用于测定抗体，后者常用于测定抗原。该法在临诊上可检测体液中各种蛋白质、激素、细菌毒素、病原的抗体抗原等，所以可检测各种寄生虫病、细菌和病毒性传染病，检测样品可以是体液、血液、粪便及任何器官组织。

（1）间接法　将已知抗原吸附（包被）于固相载体（聚苯乙烯酶联板），孵育后洗去未吸附的抗原，随后加入含有特异性抗体的被检血清，然后洗涤未起反应的物质，加入酶标抗同种球蛋白（如被检血清是猪血清，则需用抗猪球蛋白），作用后再经洗涤，加入酶底物，底物被分解后出现颜色变化，颜色变化的速度及程度与样品中抗体的量有关，即样品中的抗体越多，颜色出现越快、色越深。再用酶联免疫检测仪检测吸光度值。

（2）双抗体夹心法　本法是检测抗原的方法，将特异性免疫球蛋白吸附于固相载体（聚苯乙烯酶联板）表面，然后加入含有抗原的溶液，使抗原和抗体在固相表面形成复合物，洗除多余的抗原，再加入酶标记的特异性抗体，作用后冲洗，加入酶的底物，颜色的改变与被测样品中的抗原量成正比。然后用酶联免疫检测仪检测吸光度值。

2.斑点酶联免疫吸附试验

将待检查抗原样点在处理好的硝酸纤维滤膜（孔径0.45μm）的圆圈内，而后用异种动物血清、牛血清白蛋白或明胶溶液等进行封闭处理，随后将上述硝酸纤维滤膜置于工作浓度的猪阳性血清中进行处理，再加酶标兔抗猪免疫球蛋白G作用一定时间，再加底物溶液作用5～20分钟后，终止反应显色，等硝酸纤维滤膜干燥，判断结果。“-”表示硝酸纤维滤膜不呈现斑点，与阴性对照相同；“+”表示斑点较弱或点内有不均质的棕色点；“++”表示斑点浅棕色，对比度清晰；“+++”介于++和++++两者之间；“++++”表示斑点深棕色，背景白色。出现阳性反应的血清最高稀释度为该血清的斑点检测效价。

检测抗体的方法与检测未知抗原的方法类同，只是点样时用已知抗原点样，封闭后将点样后的硝酸纤维滤膜，按点样格子剪成小块，置入系列稀释的待检血清（1∶10，1∶50，1∶100，1∶200，…，1∶6400，1∶12800）中。同时，设阳性和阴性血清对照，37℃作用1小时，然后用洗涤液洗涤3次，每次3分钟，后面的操作同检测未知抗原时的一致。

（五）免疫胶体金技术

免疫胶体金技术的基本原理是以微孔滤膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检标本后，经滤膜的毛细管作用或渗滤作用使标本中的抗原或抗体与膜上包被的抗体或抗原结合，再用胶体金结合物标记而达到检测目的（胶体金反应原理模式见图3-1）。该技术可快捷迅速得出结果；灵敏准确，结果受外界影响较少；可长期保存；安全简便，不需仪器和设备；成本少，所需试剂和样本量少。

在养猪生产实践中，用该技术可快速得出诊断结果或监测结果，如通过监测抗体滴度来快速检验疫苗质量并确定免疫最适剂量；通过监测母源抗体及时做出是否给母猪免疫接种和给仔猪超前免疫的决策；通过监测猪群的抗体滴度及时得知猪群的免疫水平或疫病的流行情况，以便及时采取相应措施。

（六）固相免疫吸附凝集技术

该技术是固相免疫测定技术与凝集反应或病毒血凝试验相结合的新型免疫检测技术。最有实用价值的为红细胞固相吸附试验，用于病毒感染早期诊断，敏感性与ELISA和放射免疫测定法相当或甚至更高，特异性极高，试剂也经济，来源广泛，无需特殊设备，操作比其他固相免疫技术简单，国外已广泛应用。方法是首先用抗某种动物IgM的抗体包被固相载体（PVC软板），再加入病毒抗原，后加入新鲜敏感的红细胞显示反应结果。

为扩大本技术的应用范围，用抗原或抗体致敏红细胞来显示反应结果，前者称间接红细胞固相吸附试验，用于检测特异性IgM抗体，诊断病原的早期感染；后者称反向间接红细胞固相吸附试验，它既可用双抗体夹心法检测抗原，又可用间接法检测抗体。用阅读放大镜观察结果：呈钮扣状沉淀物视为阴性；呈网状凝集视为阳性；小钮扣伴小片纱状为可疑。阳性标本按需再做滴度测定。

（七）单克隆抗体技术

该技术用细胞融合技术将免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，通过筛选，经单个细胞无性繁殖后使每个克隆能持续地产生只作用于某一个抗原决定簇的抗体的技术。在疾病的诊断、预防和治疗等，显示出巨大的生命力。我国猪瘟单克隆抗体诊断试剂已在中国兽药监察所研制成功。该技术具有简便、快速、准确、省时、低廉等特点，推广应用前景广阔。

（八）聚合酶链式反应（PCR）

PCR是模拟体内DNA的复制过程，由引物介导和耐热DNA聚合酶催化，在体外扩增特异性DNA片段的一种有效方法。应用PCR技术可直接从各种组织、体液中检测到病毒，不需分离培养，且具有较高的敏感性，可检出百万分之一的感染细胞，进行单拷贝的DNA检测。随着PCR技术的应用，其操作及步骤均不断改进衍生出了多种更具优势的新种类：如PCR与核酸杂交技术相结合，可提高检测的特异性，进行快速诊断和毒株分型；逆转录PCR已广泛应用于RNA病毒的检测；常温PCR不需扩增仪即可在常温下直接扩增模板DNA或RNA，简便快速；多重PCR是在同一反应体系中加入一对以上的引物，当与各引物相对特异性互补的模板存在时，可在同一反应管中同时扩增出一条以上的目的基因，这一高度敏感、特异且简便的方法能同时将需要鉴别诊断的传染病一次得到确诊。

（九）免疫荧光试验

将抗原或抗体标记上荧光素，再进行抗原抗体反应。由于荧光素在紫外线的照射下能激发出可见的荧光，因此荧光的出现就说明标记物的存在，同时也反映了抗原抗体的存在。免疫荧光试验有直接法和间接法。其对可疑病料的检出率达100%，是一种特异、快速、准确的诊断方法。