实验十　灰色链霉菌的紫外线诱变选育

通过实验，观察紫外线对灰色链霉菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。

1.复习微生物学及实验过程所学到的微生物培养的方法和过程，了解影响微生物生长各种条件因素。

2.独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的实验过程及需要。

3.三人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，记录并分析实验中的实验现象、数据，必要时及时修改实验计划。

4.总结实验数据，经教师认定后，撰写实验报告。

物理诱变因子以紫外线辐射的使用最为普遍，尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现和被应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌中，有80%左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的。紫外线的波长在200～380nm之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253～265nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254nm。紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA变化而造成的，DNA对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中嘧啶更为敏感。紫外线引起DNA结构变化的形式很多，但其最主要的作用是引起DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），阻碍碱基间的正常配对，从而使微生物突变或死亡。经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。

1.菌种

灰色链霉菌。

2.器皿

紫外线灯（15W）；试管、锥形瓶、移液管、玻璃珠、培养皿。

3.培养基及药品

牛肉膏，蛋白胨，可溶性淀粉，NaCl，水，碘液。

1.菌悬液的制备

取培养48h的活化灰色链霉菌的斜面1～2支，用10mL无菌生理盐水将菌苔洗下，并入盛有灭菌玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡10min，以打碎菌块。菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1～10-8稀释液。

2.平板制作

将淀粉琼脂培养基熔化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。

3.紫外线处理

（1）将紫外线灯开关打开预热约20min。

（2）取直径6cm无菌平皿9套，涂平板取10-6、10-7、10-8三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1mL，用无菌玻璃刮棒涂匀。

（3）将盛有菌悬液的平皿置于紫外线灯下分别搅拌照射3min、5min及7min。

4.培养

将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48h。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。

5.计数

将培养48h后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理3min、5min、7min后的存活细胞数及其存活率、致死率。

存活率=×100%　　

致死率=×100%　　

6.观察诱变效应

将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5～6个的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。

将实验结果填入表1-6和表1-7。

表1-6　诱变结果（存活率或致死率）　　

表1-7　诱变结果（透明圈和菌落直径大小）　　

1.用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？

2.经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？