实验九　灰色链霉菌的摇瓶种子制备

学习制备摇瓶种子培养基的方法以及种子扩大培养技术。

种子扩大培养简称种子扩培，是发酵工程的一个组成部分，其指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种过程。其目的首先是出于接种量的需要与菌种的驯化，同时对于缩短发酵时间、保证生产水平也有帮助。

种子扩培的一般过程是：

斜面菌种→一级种子培养（摇瓶）→二级种子培养（种子罐）→发酵

对于种子制备过程，其大致可区分为实验室阶段和生产车间阶段，前期不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将这一培养过程称为实验室阶段的种子培养。而后期种子培养在种子罐里面进行，一般在工程上归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。并非所有的种子扩大培养都采用从摇瓶到种子罐的二级发酵模式，其实际发酵级数受到发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。

摇瓶培养技术问世于20世纪30年代，由于其简便、实用，广泛用于微生物菌种筛选、实验室大规模发酵试验、种子培养等。摇瓶培养设备主要有旋转式摇床和往复式摇床两种类型，其中以旋转式最为常用。振荡培养中所使用的发酵容器通常为三角烧瓶，也有使用特殊类型的烧瓶或试管。振荡培养技术通常用于微生物菌种的筛选或生产工艺的改良和工艺参数的优化。

在摇瓶培养过程中振荡的目的在于改善活细胞的氧气和营养物的供给。摇瓶培养通常以特定生长条件下的培养物接种，也可用孢子接种。振荡培养是建立深层发酵的开始，就一特定微生物而言，振荡培养时存在一最佳培养基配方和最佳培养基容量。细胞或孢子接种浓度对实验的成功极为重要，不同的微生物细胞或孢子以及不同的振荡培养过程的接种浓度差异可能是十分显著的，且各自存在一最适浓度。

1.菌种

灰色链霉菌（由实验八活化得到）。

2.培养基

豆饼粉20g，淀粉40g，酵母膏5g，蛋白胨5g，硫酸铵3g，硫酸镁0.25g，磷酸二氢钾0.2g，碳酸钙4g，自来水1000mL，pH7.2～7.4。

3.器材

天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、250mL三角烧瓶、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。

1.摇瓶种子培养基的制备

取干净三角烧瓶，250mL三角烧瓶分装培养基30～50mL，用棉塞包扎瓶口，再加牛皮纸包扎，在0.1MPa下灭菌45～60min。

2.接种

将活化的菌种斜面，在无菌条件下，注入10mL无菌水，振荡成孢子悬浮液（孢子浓度约为8×104个/mL）。待发酵培养基灭菌后冷却到28℃时，分别将孢子悬浮液接入三角烧瓶中，接种量为2mL，标好记号。

3.培养与观察

28℃、200r/min旋转式摇床培养24h，观察菌丝体形态及浓度。