第二节 常用细胞培养基与细胞培养基本要求

细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。细胞培养基是人工模拟体内生长的营养环境，使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力，是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。细胞培养基的组成成分主要有：水与平衡盐溶液、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及促生长因子及激素等。培养液或培养基的含义基本相同，当它是粉剂时称为培养基，而将粉剂配成液体后称为培养液。培养液中常常需补加血清、抗生素等成分。细胞培养基主要包括天然细胞培养基、合成细胞培养基和无血清细胞培养基等。

一、细胞培养基营养成分

体外培养的细胞直接生活在培养基中，因此细胞培养基应能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压、温度、pH值、水、光、气体及无菌条件、无毒、无污染等诸多方面的要求。

（一）细胞生长的营养条件

营养物和水一起，又叫细胞培养液，培养液中含有细胞增殖和生长所需要的各种物质。营养物包括N源、C源，这些物质与提供能量有关；无机盐、维生素、激素，这些物质与代谢调节控制有关。理想的细胞培养液可以同时解决细胞离体培养所需要的pH值、渗透压、营养物、调节物质的全部需要。维持细胞生长的营养条件一般包括氨基酸、单糖、维生素、无机离子与微量元素等。

1．氨基酸

氨基酸是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必需氨基酸，包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸、酪氨酸、精氨酸、胱氨酸。此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源，同样也是合成一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷所需要的基本物质。体外培养的各种细胞培养基内都含有必需氨基酸。

2．单糖

培养中的细胞可以进行有氧氧化与无氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收能力最高，对半乳糖的吸收能力最低。体外培养动物细胞时，几乎所有的细胞培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。

3．维生素

维生素是主要辅酶、辅基的成分，在细胞培养基或培养液中是必不可少的。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12均是细胞培养基或培养液常有的成分。

4．无机离子与微量元素

细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素外，还需要一些微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。

（二）促生长因子及激素

各种激素、促生长因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态具有十分重要的作用。有些激素对许多细胞生长有促生长作用，如胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素对某一类细胞有明显促进作用，如氢化可的松可促进表皮细胞的生长，泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长的作用等。

（三）渗透压

细胞内外可溶于水的物质比例和种类决定细胞的膨胀与收缩程度，因为细胞膜是半透膜，只允许对自己有利的物质通过。同一物质在细胞内外的分布数量不同，当某一种极易溶于水的物质在细胞外浓度过大时，有可能导致细胞干瘪死亡，这些物质在细胞内过多时，又可导致细胞过量吸水膨胀。细胞膜调节渗透压的能力是有限的，细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压为290 mOsm/kg，可视为培养人体细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在320 mOsm/kg左右。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在260~320 mOsm/kg范围内均适宜。

（四）pH值

动物细胞大多数需要轻微的碱性条件，pH值在7.2~7.4。在细胞生长过程中，随着细胞数量的增多和代谢活动的加强，CO2不断被释放，培养液变酸，pH值发生变化。由于NaHCO3容易分解为CO2，很不稳定，致使缓冲系统难以精确地控制。HEPES（为一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的PH值）结合碳酸氢钠使用，可提供更有效的缓冲体系，主要是防止pH值迅速变动，但最大缺点是在开放培养或观察时难以维持正常的pH值。造成细胞培养基pH值波动的原因主要是代谢产生的CO2，在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，细胞培养基pH值下降。为解决这一问题，合成细胞培养基中使用了NaHCO3－CO2缓冲系统，并采用开放培养，使细胞代谢产生的CO2及时溢出培养瓶，再通过调节细胞培养箱中CO2浓度，CO2浓度一般控制在5%，与细胞培养基中的NaHCO3处于平衡状态。培养细胞环境过酸或过碱可导致细胞死亡，这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关。

（五）温度

当温度过低时，细胞生长缓慢甚至不生长，所以利用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分化能力。温度过高导致细胞死亡，这主要是由酶和蛋白质所需要的最适温度决定的。多数生物大分子遇到高温后容易导致空间结构改变或者丧失，甚至导致变性。

（六）水

水是细胞需求量最大的物质，不同的物种、不同部位、不同生长期的细胞含水量差别相当大。干旱植物细胞的含水量高达90%。水的需求量一般应与细胞培养液同时考虑。

（七）气体

气体也是细胞生存的必需条件之一，所需气体主要是O2和CO2。O2可参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。一些细胞在缺氧情况下，通过无氧酵解也可获取能量，但多数细胞缺氧不能生存。在开放培养时，一般将细胞置于95%空气加5%CO2的混合气体环境中。CO2既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，它主要与维持细胞培养基的pH值有直接关系。CO2除了可调节pH值以外，还有缓冲作用。动物细胞需要不断供给氧气和排除CO2，植物细胞与此相反。

（八）无菌条件

体外细胞培养是仅对所需的细胞进行培养，但环境中（如空气）有各种其他微生物，必须对所需细胞进行无杂菌的隔离培养。无菌条件是细胞离体培养最基本的条件。

（九）无毒、无污染

体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此细胞培养基应达到无化学物质污染；无微生物污染，如细菌、真菌、支原体、病毒等；无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染，如抗体、补体。对于天然细胞培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合成细胞培养基，污染主要来源于细胞培养基配制过程，配制所用的水、器皿应保持洁净，细胞培养基配制后应严格过滤除菌。

二、天然细胞培养基

天然细胞培养基是指直接来自动物体液或利用组织分离提取的一类细胞培养基，如血浆、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。此类细胞培养基虽然营养价值高，但其成分复杂，差异大、不稳定，来源也受到限制。水解乳蛋白和胶原是两种较好的天然细胞培养基，富含氨基酸。组织培养技术建立早期，体外培养细胞都是利用天然细胞培养基。但是由于天然细胞培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成细胞培养基所替代。目前最有效和最常用的天然细胞培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞时也是必不可少的。

（一）血清

细胞培养能否成功，培养基的质量是关键，而在细胞培养基的主要成分中，动物血清（Serum）对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。血清的来源有胎牛血清、小牛血清、马血清、鸡血清、羊血清及人血清，最广泛应用的为胎牛血清和小牛血清。

1．血清种类

目前用于组织培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因主要包括：来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用实践人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的，但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。牛血清是细胞培养中用量最大的天然细胞培养基，其含有丰富的细胞生长必需的营养成分，具有极为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新生牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新生牛血清取自出生24h之内的新生牛；小牛血清取自出生10~30d的小牛。显然，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。

2．血清的主要成分

血清是由血浆去除纤维蛋白后，形成的一种很复杂的混合物，其组成成分大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对细胞的生长有促进或抑制作用且达到平衡状态。目前，对血清的成分和作用的研究虽有很大进展，但仍存在一些问题，一是血清的成分可能有几百种之多，目前对其准确的成分、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识；二是血清都是批量生产，各批量之间差异很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使实验的标准化和连续性受到限制；三是不能排除血清中含有易变物质，这被认为是细胞污染的主要原因之一。

3．血清主要作用

（1）血清可提供细胞生长所需的基本营养物质：如氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，所以血清是细胞生长必需的物质。

（2）血清可提供细胞生长所需的激素和各种生长因子：如胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。

（3）血清可提供细胞生长所需的结合蛋白：结合蛋白的作用是携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪以及激素等；转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。

（4）血清可提供细胞生长所需的促接触因子和伸展因子：使细胞易于贴壁而免受机械损伤，可对培养中的细胞起到保护作用。

（5）血清对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，可起到中和作用。这种作用是偶然发现的，现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的黏度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，黏度起到重要作用。

（6）血清还含有一些微量元素和离子，它们在代谢解毒中起重要作用，如氧化硒（SeO3）和硒（Se）等。

4．细胞培养中使用血清的缺点

血清成分复杂，虽然含有许多对细胞有利的成分，也含有对细胞有害的成分，使血清有以下几个明显的缺点：①对大多数细胞，在体内状态血清不是它们接触的生理学液体，只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态，血清可能促进某些细胞的生长，如成纤维细胞，同时抑制另一类细胞生长，如表皮细胞；②血清含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应，如精胺、亚精胺，形成有细胞毒性作用的聚精胺，补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡；③动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致；④取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠；⑤血清的使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成。

5．血清的质量标准

血清质量高低取决于两方面因素：一是取材对象，二是取材过程。用于取材的动物应健康无病并且在指定的出生天数之内，取材过程应严格按照操作规程执行，制备的血清要经过严格的质量鉴定。对牛血清的质量也有严格的要求，包括蛋白质含量、细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素，支持细胞增殖检查。血清质量的鉴定一般包括：理化性质、微生物检测及促生长效果等方面。

（1）理化性质：如渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等。蛋白含量包括血清总蛋白含量，一般要求不低于35~45g/L；球蛋白含量，应小于20g/L；血红蛋白含量等。其中球蛋白含量是一项非常重要的指标，血清中球蛋白主要是抗体，球蛋白含量越低，血清质量越高。血红蛋白含量也是越低越好。

（2）微生物检测：包括细菌、真菌、支原体、病毒等。特别是对支原体、病毒的检测，支原体是一种很小的微生物，可通过孔径22μm的滤膜。支原体、病毒污染在光学显微镜下难于察觉，细胞也能生长繁殖，但会影响实验结果。目前，检测支原体的方法很多，如培养法、PCR法、荧光染色法、电镜观察法等。

（3）促生长效果：促生长效果是血清重要的特性之一，应当以培养的细胞来检测。检测促生长效果的方法有克隆形成率测定法、贴瓶率测定法和连续传代培养法。

①克隆形成率测定法：一般以悬浮生长的细胞为培养对象，按有限稀释法做克隆化培养，将不同批号的血清配制成不同浓度的培养基，细胞也稀释成不同浓度，接种到96孔板，每孔200μL，培养一定时间，统计有克隆生长的孔，计算出百分比，再与对照的标准血清相比较，可检测出不同批号血清间的区别。比较低的浓度，更能观察出血清质量间的细微差别。

②贴瓶率测定法：是以贴壁细胞为培养对象，将细胞稀释至低密度，接种至平皿，每皿200个或100个细胞，以不同浓度的血清培养基培养，培养一定时间后弃培养基，染色后统计集落数，计算出集落数占接种细胞数的百分比，同样再与标准血清比较，判断血清质量高低。

③连续传代培养法：是将细胞培养于3个一定体积的培养瓶中，待测血清配制为5%浓度，一般于第7天收集细胞，计数，取平均值，中间可以更换一次细胞培养基。连续测试3个周期以上，观察细胞生长状况，并将每次的计数结果与标准血清的测试结果比较，判断血清质量高低。

对于使用者，判断血清质量先从外观入手。好的血清应该是透明清亮的，呈土黄色或棕黄色，无沉淀或极少沉淀，比较黏稠。如发现血清浑浊、不透明、含有许多沉淀物，说明血清污染或血清中的蛋白质变性；若血清呈棕红色，说明血清中的血红蛋白含量较高，取材时有溶血现象；如果摇晃时感觉液体稀薄，说明血清中掺入的生理盐水过多。如果要进一步了解血清的质量，则应连续培养某些细胞，观察细胞生长状况。

6．血清的使用与储存

正确地使用及保存血清，才能使血清发挥应有的作用。

（1）使用前处理：大部分血清在使用前必须灭活处理，即将血清放在56℃水浴锅内，水浴30min。灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用。血清经过灭活也会损失一些对细胞有利的成分，如生长因子，因此也有人提出血清不经灭活直接用于培养，这样做的前提是确认血清中不含补体成分。对于一些品质高的胎牛血清和新生牛血清可以考虑不经灭活直接用于细胞培养。

（2）储存条件：血清一般储存于－20℃下，同时应避免反复冻融。购买大包装的血清后，首先要灭活处理，然后分装成小包装，储存于－20℃下，使用前融化，融化时最好先将血清置于4℃下。融化后的血清在4℃下不宜长时间存放，应尽快使用。

（3）使用浓度：血清作为合成细胞培养基的一种添加成分，与合成细胞培养基混合使用，使用浓度一般为5%~20%，最常用的是10%。过多血清容易使培养中的细胞发生变化，特别是一些二倍体的无限细胞系，迅速生长之后容易发生恶性转化。

（二）水解乳蛋白

水解乳蛋白（Lactalbumin hydrolysate）为乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物，含有丰富的氨基酸，是常用的天然细胞培养基，可用于许多细胞和原代细胞的培养。细胞培养中一般为0.5%水解乳蛋白（用平衡盐溶解）与合成细胞培养基（如MEM）按1∶1混合使用。目前在生产中主要用于地鼠肾细胞等细胞的培养和维持。

（三）胚胎浸出液

胚胎浸出液（Embryonic extract）是早期动物细胞培养中应用的天然细胞培养基，现已很少使用。

三、合成细胞培养基

合成细胞培养基是根据天然细胞培养基的成分，用化学物质模拟合成、人工设计、配制的细胞培养基。合成细胞培养基是用化学成分明确的试剂配制的培养基，组分稳定，主要包括糖类、必需氨基酸、维生素、无机盐类等。自1950年199细胞培养基问世以来，合成细胞培养基发展至今已有几十种，除了基础合成细胞培养基之外，近年来还出现了营养成分更加丰富的低血清细胞培养基。由于细胞种类和培养条件不同，适宜的合成细胞培养基也不同。由于天然细胞培养基的一些营养成分不能被合成细胞培养基完全代替，因此一般需在合成细胞培养基中添加5%~10%的小牛血清。小牛血清的加入对细胞培养非常重要，但小牛血清的成分复杂，这对培养产物的分离纯化和检测会带来一定的不便，为减少小牛血清的影响，开发了营养成分更加丰富的低血清细胞培养基，可以将小牛血清的使用量降低到1%~3%。

（一）基本组分

合成细胞培养基的基本组分包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。

1．无机盐

常用的合成细胞培养基中的无机盐有氯化钙（CaCl2）、氯化钾（KCl）、硫酸镁（MgSO4）、氯化钠（NaCl）、碳酸氢钠（NaHCO3）、磷酸二氢钠（NaH2PO4）等。这些无机盐对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必需的。

2．氨基酸

常用的合成细胞培养基中的氨基酸有缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸、酪氨酸、精氨酸、L型胱氨酸。它们都是细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能由其他氨基酸或糖类转化合成。除此之外，还需要谷氨酰胺。谷氨酰胺具有特殊的作用：能促进各种氨基酸进入细胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，还是合成一磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷的原料。细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应补加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不稳定，在4℃下放置1周可分解50%，使用中最好单独配制，置于－20℃冰箱中保存，用前加入培养液中。

3．维生素

维生素（Vitamin）是一系列有机化合物的统称。它们是生物体所需要的微量营养成分，而一般又无法由生物体自己生产。维生素是维持细胞生长的一种生物活性物质，在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对细胞代谢有重大影响。维生素包括脂溶性维生素（Lipid soluble vitamin）和水溶性维生素（Water soluble vitamin）两大类。脂溶性维生素是由长的碳氢链或稠环组成的聚戊二烯化合物。脂溶性维生素常从血清中得到补充，包括维生素A（抗干眼醇）、维生素D（钙化醇、抗佝偻病维生素）、维生素E（生育酚、抗不育维生素）及维生素K（抗出血维生素）等。水溶性维生素是能在水中溶解的一组维生素，常是辅酶或辅基的组成部分，包括B族维生素和维生素C（抗坏血酸）等。B族维生素主要有维生素B1（硫胺素）、维生素B2（核黄素）、维生素B3（烟酸、尼克酸、维生素PP）、维生素B4（腺嘌呤）、维生素B5（泛酸）、维生素B6（包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺3种）、维生素B7（生物素）、维生素B12（钴胺素）、维生素B13（乳酸清）、维生素B15（潘氨酸）、烟酸、泛酸、叶酸等，对具有合成胶原能力的细胞更为重要。

4．碳水化合物

碳水化合物是细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖和丙酮酸钠等。体外培养动物细胞时，几乎所有细胞培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能量来源物质。

5．葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用

乳酸是葡萄糖不完全氧化的产物。研究表明，体外培养条件下95%的葡萄糖转变为乳酸，降低了营养物质的代谢效率，降低细胞培养基pH值，增加渗透压。在氧气供给不足的情况下，NADH转运系统苹果酸一天冬氨酸穿梭系统活性低而不能将糖酵解产生的NADH氧化磷酸化为NAD+，细胞只能以降低能量需求的方式，如激活乳酸脱氢酶，将糖酵解产生的丙酮酸与NADH反应生产乳酸和NAD+，从而保证了糖酵解的顺利进行。另一个可能的解释是连接糖酵解与三羧酸循环（Tricarbo xylic acid cycle）的特异性酶活性低下，直接导致糖酵解与TCA循环的失衡。因此在体外培养条件下，葡萄糖主要经糖酵解降解，产生过量的乳酸。减少乳酸产生最常用的方法是限制细胞培养基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量过低可造成细胞营养供应不足，细胞生长抑制。该方法需要对葡萄糖的消耗与需求、乳酸的生产速率以及目的蛋白的表达量等参数进行综合考虑方可应用。

在目前常用的细胞培养基中，葡萄糖和谷胺酰胺是体外培养动物细胞的主要能源，其能量代谢通路与体内完全不同，表现为葡萄糖主要经糖酵解途径为细胞提供能量，谷胺酰胺大部分通过不完全氧化途径，另一小部分通过完全氧化为细胞供能。因此，适当的调整细胞内的代谢途径，使之能促进细胞的快速生长和产物合成，同时减少代谢抑制物的生成是一种有效的方法。

许多动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary, CHO）、幼地鼠肾细胞（Baby hamster kidney cell, BHK）和杂交瘤细胞对营养物质葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而对于细胞生长而言，二者的快速利用并非细胞必需；相反相当一部分转化为代谢废物乳酸和氨，以及一些非必需氨基酸，如丙氨酸，脯氨酸。其中，乳酸和氨是两种主要代谢废物，其积累可影响细胞生长。减少这两种代谢产物的积累，是大规模细胞培养技术研究的重要方向。氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺产生的。限制细胞培养基中谷氨酰胺的含量亦是减少氨生成的常用方法。

6．其他组分

除了以上与细胞生长有关的物质以外，细胞培养基中一般还要加入酚红。酚红是一种pH值指示剂，当溶液呈酸性时，pH值小于6.8，呈黄色；当溶液呈碱性时，pH值大于8.4，呈红色。在较为复杂的培养液中还包括核酸降解物如嘌呤和嘧啶两类以及氧化还原剂如谷胱甘肽等。有的细胞培养液还直接加入了三磷酸腺苷和辅酶A。

（二）常用基础细胞培养基

细胞培养基通常指基础合成细胞培养基，主要成分为氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅助物质（核酸降解物、氧化还原剂等）。常用基础细胞培养基包括：DMEM细胞培养基、RPMI-1640细胞培养基、DMEM/F12细胞培养基、HamF10/F12细胞培养基、BME细胞培养基、MEM细胞培养基、199细胞培养基、IMEM细胞培养基、McCoy's 5A细胞培养基及Fischer's细胞培养基等。

1．DMEM细胞培养基

DMEM是达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified eagle's medium），是一种含各种氨基酸和葡萄糖的细胞培养基，是在MEM细胞培养基的基础上研制的。与MEM细胞培养基比较，DMEM细胞培养基增加了各种成分的用量，同时又分为高糖型（低于4500mg/L）和低糖型（低于1000mg/L）。生长快、附着性稍差的肿瘤细胞培养、克隆培养时用高糖型效果较好，常用于杂交瘤的骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞培养。该类细胞培养基被广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养。

2．RPMI-1640细胞培养基

RPMI-1640细胞培养基是由Hoore等于1967年在Roswell Park Memorial Institute研制的，主要针对淋巴细胞培养设计，由平衡盐溶液、21种氨基酸与11种维生素等组成，广泛用于多种正常细胞和肿瘤细胞培养，也可用于悬浮细胞培养。

3．DMEM/F12细胞培养基

DMEM细胞培养基和F12细胞培养基按照1∶1比例混合效果最佳，营养成分丰富，且可以使用较少血清，或作为无血清培养基的基础培养基。

4．HamF10/F12细胞培养基

HamF10/F12细胞培养基是由Ham设计的，含微量元素，可在血清含量低时用，适用于克隆化培养。F10适用于仓鼠、人二倍体细胞，特别适合于羊水细胞培养。

5．BME细胞培养基

BME细胞培养基即基础Eagle培养基（Basal medium eagle），由Eagle设计，由平衡盐溶液、12种氨基酸、谷氨酰胺与8种维生素组成。简单、便于添加，适于各种传代细胞系和特殊研究用，在此基础上改良的细胞培养基品种有MEM、DMEM、IMEM细胞培养基等。

6．MEM细胞培养基

MEM细胞培养基即低限量Eagle培养基（Minimal essential medium），是动物细胞培养中常用的细胞培养基，主要用于贴壁细胞的培养。在1959年被修改，删去赖氨酸、生物素，增加氨基酸浓度，修改配方后也可用于其他类型细胞培养，适合多种细胞单层生长，有可高压灭菌品种，是一种最基本、适用范围最广的细胞培养基。

7．199细胞培养基

1950年由Morgar等设计，首次将人工综合的199细胞培养基用于鸡胚组织细胞的培养。199细胞培养基除平衡盐溶液外，含有53种成分，为全面培养基。人工综合细胞培养基具有成分明确、稳定不变等优于天然细胞培养基的特点，常用于各类细胞培养，广泛用于病毒学研究、疫苗生产。

8．IMEM细胞培养基

IMEM细胞培养基是由Iscove's改良的Eagle培养基，增加了几种氨基酸和胱氨酸含量。

9．McCoy's 5A培养基

1959年MeCoy为肉瘤细胞设计，由平衡盐溶液与40种成分组成，用于正常和肿瘤细胞，可支持多种如骨髓、皮肤、肺和脾脏等的原代移植物的生长，除适用于一般的原代细胞培养外，主要用于组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长支持。

不同类型细胞在培养时要选择适合的培养基，有关不同类型细胞推荐使用的培养基见表1-4。

（三）干粉细胞培养基的配制

1．配制干粉细胞培养基应注意的问题

配制干粉细胞培养基要注意以下问题：①认真阅读说明书，说明书都注明干粉不包含的成分，如NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。②配制时要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。③配制所用的水应是三蒸水或去离子水，离子浓度很低。④所用器皿应严格消毒。⑤配制好的细胞培养基应尽快过滤，无菌保存于4℃下。

2．配制方法

以1640细胞培养基为例介绍干粉细胞培养基的配制方法：①在一个尽可能接近总体积的容器中加入比预期细胞培养基总体积少5%的三蒸水或去离子水（约900mL）。②称取10.4g 1640，加入三蒸水或去离子水中，轻轻搅拌，不要加热，等完全溶解后再加后面组分。③溶解后，先加入0.8g NaHCO3，使其充分溶解。④溶解后，加入HEPES（Buffer）4.9g（25mmol），使其充分溶解。⑤溶解后，再加入抗生素（青霉素50mg，链霉素50mg），用三蒸水或去离子水定容到1000mL，搅拌溶解。注意不要过分搅拌。⑥通过缓慢搅拌加入1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节pH值为7.0~7.1，由于pH值在过滤时会上升0.1~0.3，所以应调节pH值，使它比最终想要的pH值低0.2~0.3。⑦调节pH值后，用0.22μm微孔滤膜过滤到消毒无菌瓶中。⑧使用前按比例加入一定量的小牛血清或胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）。

四、无血清细胞培养基

无血清培养基（Serum free medium, SFM）是指在使用中无须添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的细胞培养基，且其组成成分不含任何动物组分。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。按照组分不同可以将其分为无动物组分无血清细胞培养基和化学限定无血清细胞培养基，前者组分中可能含有某些植物来源成分，而后者完全由化学成分明确的组分组成。其中，无动物组分无血清细胞培养基是目前在医学研究中应用最广泛的，它提高了细胞培养的质量，避免了使用血清带来的麻烦。目前，已有多种无血清细胞培养基上市，如杂交瘤细胞无血清培养基、CHO细胞无血清培养基、Vero细胞无血清培养基和NSO细胞无血清培养基等。无血清细胞培养基通常添加生长附加成分，如激素与生长因子、低分子营养成分和转铁蛋白等促细胞生长的成分，一般包括胰岛素、孕酮、硒酸钠、腐胺、转铁蛋白等。

（一）无血清细胞培养基的基本配方

基本成分为基础细胞培养基及添加组分两大部分。用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长。而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子，如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原等，细胞往往以悬浮形式生长。无血清细胞培养基添加组分包括：促贴壁物质、促生长因子及激素、酶抑制剂、结合蛋白和转运蛋、微量元素等几大类物质。

1．促贴壁物质

许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清细胞培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质如纤粘连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化起着重要作用。纤粘连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO、成肌细胞等。

2．促生长因子及激素

针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞生长必不可少的，如胰岛素。

3．酶抑制剂

培养贴壁生长的细胞需要用胰酶消化传代，在无血清细胞培养基中必须有酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制剂。

4．结合蛋白和转运蛋白

转铁蛋白和牛血清白蛋白是常见的结合蛋白和转运蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加细胞培养基的黏度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清细胞培养基都含有牛血清白蛋白。

5．微量元素

硒是最常见的微量元素。

（二）使用方法

目前，血清仍是动物细胞培养中最基本的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，一般先使用有血清的细胞培养基进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清细胞培养基。细胞转入无血清细胞培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%、3%、1%，直至无血清培养。在降低血清浓度过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清细胞培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的细胞培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。

为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞处于对数生长中期；活细胞率>90%；适应时以较高的起始细胞接种。现有两种方法可使细胞适应无血清细胞培养基：直接适应和连续适应。

1．直接适应

直接适应是指细胞从添加血清的细胞培养基直接转换到无血清细胞培养基中。一些类型细胞可直接从包含血清的细胞培养基适应无血清细胞培养基。对于直接适应，接种细胞密度应该是2.5×105~3.5×105个/mL；当细胞密度达到1×106~3×106个/mL时，可传代培养细胞；当细胞密度在培养4~7d后达到2×106~4×106个/mL时，细胞完全适应了无血清细胞培养基；每隔3~5d，当细胞密度达到1×106~3×106个/mL，细胞存活率在90%时，贮备的适应了无血清细胞培养基的细胞培养物应该再次传代培养。

2．连续适应

连续适应是指分几步把细胞从添加血清的细胞培养基转换到无血清细胞培养基中，与直接适应相比较，连续适应趋向对于细胞更加温和一些。

以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75%有血清细胞培养基：25%无血清细胞培养基混合培养基中，传代培养；当细胞密度>5×105个/mL时，以2×105~3×105个/mL细胞密度，在有血清细胞培养基∶SFM为50∶50的混合细胞培养基中传代培养；以2×106~3×106个/mL细胞密度，25%有血清细胞培养基和75%无血清细胞培养基中传代培养；当细胞密度达到1×106~3×106个/mL（接种后4~6d），在100%无血清细胞培养基中传代培养；每隔3~5d，当细胞密度达到1×106~3×106个/mL，细胞存活率在90%时，所贮备的适应了无血清细胞培养基的细胞培养物应该再次传代培养。

建议备份前一次混合培养的培养物，直到每一次细胞适应了新的混合细胞培养基。每一次减少血清前，可能需要在无血清细胞培养基/有血清混合培养基中进行几次传代。在适应过程中，最好不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意，与有血清细胞培养基相比，大部分无血清细胞培养基包含非常少的蛋白质，因而更易于受外界因素的影响。

3．细胞培养适应替代血清

许多细胞利用连续适应方法能很好地适应，用包含FBS的细胞培养基和包含有替代血清的细胞培养基1∶1的混合细胞培养基培养细胞。通过下列的混合细胞培养基的方式，连续几代减少当前细胞培养基的量，1∶2, 1∶4, 1∶16和100%替代细胞培养基。每次适应改变血清比例时，传代细胞2~3次。培养可以直接从FBS转换到替代血清。一开始就使用相同于FBS浓度的替代物或血清，生长的延迟可能会发生，允许进行2~3次的传代，使生长率恢复到以前的水平。

特别需要强调的是配制无血清细胞培养基必须使用高质量的水，如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。因为无血清细胞培养基缺乏血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子，即便水中的有毒物质含量甚微，也可能对细胞产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一。

使用无血清细胞培养基的优点很多，包括：使用无血清细胞培养基可增加确定性；可使细胞的性能更加一致；容易进行纯化和下游加工；细胞功能的精确评估；可增强细胞的生长和/或产量；生理反应性的较好对照；增强细胞内中介物的检测。

五、无蛋白培养基与限定化学成分培养基

1．无蛋白培养基

无蛋白培养基（Protein free midium, PFM）是指不含有动物蛋白的培养基。无血清细胞培养基仍含有较多的动物蛋白，如胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白等。从生物技术发展的趋势来看，不含动物蛋白的细胞培养基有广泛的应用前景，许多利用基因工程技术重组的蛋白质最终要应用于人体，如果再生长过程中使用了含有动物蛋白质的细胞培养基，纯化过程就比较复杂，最终要达到一定的质量标准也有一定的难度。无蛋白培养基就是为了适应这种发展趋势而出现的，许多无蛋白培养基添加了植物水解物以替代动物激素、生长因子的作用。市场上已有适合多种细胞生长的无蛋白培养基。

2．限定化学成分培养基

限定化学成分培养基（Chemical defined medium, CDM）是指培养基中的所有成分都是明确的，它同样不含动物蛋白，不添加植物水解物，而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。这种培养基更有利于分析细胞的分泌产物。目前已经有适合于293细胞（人肾上皮细胞系，有多种衍生株，如HEK293, 293T/17等）、CHO细胞、杂交瘤细胞生长的限定化学成分培养基问世，水解乳蛋白培养基就属于限定化学成分培养基。

六、其他细胞培养用液

在细胞培养过程中，除了培养基外，还经常用到一些平衡盐溶液、消化液、pH值调整液等。

（一）平衡盐溶液

平衡盐溶液（Balanced salt solution, BSS）主要由无机盐、葡萄糖组成，它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH值稳定及提供简单的营养。BSS主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。最简单的BSS是Ringer。D-Hank's与Hank's的一个主要区别是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有较高的NaHCO3（2.2g/L），适合于5%CO2的培养条件，Hank's平衡液仅含有0.35g/L NaHCO3，不能用于5%CO2的环境，若放入CO2培养箱，溶液将迅速变酸，使用时应注意。

配制溶液应使用双蒸水或去离子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，应当首先溶解这些成分。配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温灭菌。下面简单介绍几种细胞培养常用缓冲液及平衡盐溶液。

1．磷酸盐缓冲液

磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline, PBS）是细胞培养过程中最常用的缓冲溶液。它是一种水基盐溶液中含有氯化钠、磷酸纳盐以及氯化钾和磷酸钾。缓冲液有助于保持恒定的pH值。溶液的渗透压和离子浓度通常与人体pH相近。主要用于一些化学实验中不影响实验反应的情况下调节pH值，以便让实验的化学反应在最佳条件下进行。还常用于Elisa方法的洗板及细胞培养过程中稀释缓冲液。

配制方法：称取7.9g NaCl, 0.2g KC1, 0.24g NaH2PO4（或1.44g Na2HPO4）和1.8g K2HPO4，溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加去离子水或双蒸水定容至1000mL。4℃保存，使用时按比例配制成所需pH值浓度，高压灭菌后室温保存。

需要注意的是，通常所说的浓度0.01mol/L指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度，而非钠离子或钾离子的浓度，钠离子和钾离子只是用来调节渗透压的。

2．Hank's液

Hank's液（Hank's balanced salt solution, HBSS）是生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液。主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞清洗液、配制培养液及其他试剂等，而不能单独作为细胞组织培养液。D-Hank's与Hank's的一个主要区别在于前者不含钙离子和镁离子，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。

（1）母液甲（20×）配法：①称取160g NaCl、8g KCl、2g MgSO4·7H2O、2g MgCl2·6H2O依次溶于800mL双蒸水中，前一物质溶后再加后一种；②称取2.8g CaCl2溶于100mL双蒸水中，溶解时不断搅拌，此液应该单独配制，单独溶解。待上述两溶液中的溶质全溶后，将它们混合，再用双蒸水定容至1000mL，向其中加2mL氯仿作为防腐剂，置4℃保存。

（2）母液乙（20×）配法：①称取3.04g Na2HPO4·12H2O、1.20g KH2PO4、20.0g葡萄糖溶于800mL双蒸水中；②0.4%酚红液：称取0.4g酚红放在玻璃研钵后加0.01mol/L的NaOH 11.28mL，直到全部溶解，移入100mL容量瓶中，加水至100mL，过滤，pH值调至7.4, 4℃保存。待上述各溶质完全溶解后，用双蒸水定容至1000mL，其中加氯仿2mL作防腐剂，置40℃保存。

（3）使用液（1×）配法：取母液甲和母液乙各一份，加双蒸水18份，分装后，塞好瓶塞，挂上标志。以115℃高压灭菌25min，以免葡萄糖破坏，置室温后4℃保存，可使用几个月。临用前，用7.5%NaHCO3调至所需pH值。

3．平衡盐溶液

平衡盐溶液（BSS）——无钙、镁离子溶液，主要是由无机盐、葡萄糖组成，它的作用是维持细胞渗透压平衡、保持pH值稳定及提供简单的营养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。

配制方法：称取氯化钠（NaCl）8g、磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）0.05g、氯化钾（KCl）0.2g、碳酸氢钠（NaHCO3）1g、柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·H2O）1g、葡萄糖1g、加去离子水或双蒸水定容至1000mL。

4．Eagle's液

Eagle's液（Eagle's balanced salt solution, EBSS）是一种在二氧化碳环境中短期维持细胞活性的平衡盐溶液，可用于细胞解离前的清洗、细胞或组织的运输、细胞计数时稀释、溶液的配置等。

5．HEPES液

HEPES液是生物缓冲液，化学性质稳定，在pH值7.2~7.6范围内，比NaHCO3缓冲液的缓冲能力更强。

6．NaHCO3缓冲液

NaHCO3缓冲液是常规缓冲体系的一部分，但是不稳定，易受空气中CO2的含量而改变pH值，影响缓冲效果。

（二）消化液

取材进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液，传代培养时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消化下来，常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）溶液，有时也用胶原酶（Collagenase）溶液。

1．胰酶溶液

胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常见的有1∶125和1∶250，即一份胰酶可消化125份或250份酪蛋白。组织培养用胰酶溶液一般配制成0.1%~0.25%浓度，配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液（如D-Hank's液），因为这些物质会对胰酶产生抑制作用。胰酶作用及溶解的最佳pH值是8~9，配制胰酶溶液应将液体pH值调至8左右，充分溶解，过滤除菌。过滤后可以再调pH值为7.5，也可不调。

配制方法：使用细胞清洗液配制胰酶消化液，含0.5%胰酶的细胞清洗液（100mL细胞清洗液加0.5g胰酶），过滤除菌，分装于4℃保存。

2．EDTA溶液

EDTA溶液也常用来解离细胞，它的作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞，还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。

配制方法：EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶，配制后可过滤除菌，也可高温消毒灭菌。

3．胶原酶溶液

胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤，胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用。胶原酶的使用浓度为0.1~0.3mg/L或200000 U/L，作用的最佳pH值为6.5。胶原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制时可用PBS缓冲液。

（三）pH值调整液

在细胞培养中，pH值调整液常用的有NaHCO3溶液和HEPES溶液。

1．NaHCO3溶液

NaHCO3是细胞培养基中必须添加的成分，一般情况下按说明书的要求准确添加，以保证细胞培养基在5%CO2的环境下pH值达到设计标准。如果是封闭式培养，即不与5%CO2的环境发生交换达到平衡，所使用的细胞培养基就不能按照说明书所要求加入NaHCO3。此时常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液调节细胞培养基，使之达到所要求的pH值环境。

2．HEPES溶液

4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES]溶液是一种弱酸，对细胞无毒性作用。HEPES是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围，主要作用是防止细胞培养基pH值迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH值迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH值在7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES。使用终浓度为10~50mmol/L，一般培养液内含20mmol/L HEPES即可达到缓冲能力。

（四）抗生素

在培养细胞时常用的抗生素是青、链霉素，俗称“双抗溶液”。青霉素主要对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。通常使用青霉素终浓度0.007~0.008g/100mL，链霉素终浓度0.01g/100mL。一般配制成100倍浓缩液，可用PBS缓冲液或细胞培养基配制。

（五）谷氨酰胺补充液

谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成细胞培养基中均需添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，容易降解，所以必须在使用前添加。配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内。

配制方法：谷氨酰胺使用终浓度为0.002mol/L。一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mmol/L（29.22g/L），配制时应加温30℃完全溶解后过滤除菌，分装至小瓶，储存于－20℃使用时，在每100mL培养液中加入0.5~2mL谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1~4mmol/L。

（六）二肽谷氨酰胺

二肽谷氨酰胺即L－丙氨酰－L－谷氨酰胺。在细胞培养液中L－谷氨酰胺是大部分细胞培养基的基本成分；而L－谷氨酰胺是一种并不稳定的氨基酸，在中性的水溶液中会自发降解；需要频繁地补加L－谷氨酰胺。因而在培养操作过程中经常：①频繁打开盖子，增加了破坏无菌状态的可能性；②过多地追加L－谷氨酰胺，增加了细胞培养基中氨的毒性水平。二肽谷氨酰胺在细胞培养中稳定而不易降解，可高压灭菌，释放毒性氨最少。二肽谷氨酰胺在细胞内被氨肽酶所水解，产生L－谷氨酰胺和L－丙氨酸；因此在大部分细胞系统中，二肽谷氨酰胺可以与L－谷氨酰胺一样有效地被利用。二肽谷氨酰胺是最优替代物，它无须适应；既可用于贴壁细胞培养，也适合于悬浮细胞的培养。

七、不同细胞培养所需的培养条件

（一）动物细胞培养

在所有的细胞离体培养中，最困难的是动物细胞培养。下面是动物细胞培养时所需要的特殊条件。

1．血清

动物细胞离体培养常常需要血清，最常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。血清是动物细胞离体培养的天然营养液。

2．支持物

大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃、塑料等作为支持物。

3．气体交换

二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件，每一次开箱操作后的快速恢复对设备的要求非常重要。

（二）植物细胞培养

1．光照

离体培养的植物细胞对光照条件不甚严格，因为细胞生长所需要的物质主要是靠细胞培养基供给的。但光照不但与光合作用有关，而且与细胞分化有关，例如，光周期可对性细胞分化和开花调控作用，所以以获得植株为目的的早期植物细胞培养过程中，光照条件特别重要。以植物细胞离体培养方式获得重要物质，如药物作用的过程，植物细胞大多在反应器中悬浮培养。

2．激素

植物细胞的分裂和生长特别需要植物激素的调节，促进生长的生长素和促进细胞分裂的分裂素是最基本的激素。植物细胞的分裂、生长、分化和个体生长周期都有相应的激素参与调节。和动物细胞相比，植物细胞离体培养对激素要求的原理已经了解，其应用技术也已相当成熟，已经有一套广泛作为商品使用的细胞培养基。同时解决了植物细胞对水、营养物、激素、渗透压、酸碱度、微量元素等的需求。

（三）微生物细胞培养

微生物多为单细胞生物，野生生存条件比较简单。所以微生物人工培养的条件比动、植物细胞培养简单得多。其中厌氧微生物培养比需氧微生物复杂，因为严格厌氧需要维持二氧化碳等非氧的惰性气体浓度，而需氧微生物则只需要通过不断搅拌提供无菌氧气。微生物对培养条件要求不如动、植物细胞那样苛刻，玉米浆、蛋白胨、麦芽汁、酵母膏等成为良好的微生物天然细胞培养基。对于一些特殊微生物的营养条件要求，可以在这些天然细胞培养基的基础上额外添加。

八、细胞培养基灭菌

细胞培养基的灭菌方法主要有两种，高压除菌及0.22μm微孔滤膜过滤除菌。与过滤相比，高压灭菌的工作强度小，相对便宜，失败率低，但易造成营养成分的流失。

1．高压灭菌

某些细胞培养基（如MEM）可进行高压灭菌。其中不含有L－谷氨酰胺和碳酸氢钠，可在高压灭菌后加入。另外可高压的谷氨酸盐（如L－丙氨酰－L－谷氨酰胺）可代替L－谷氨酰胺。为保证高压灭菌的效果，灭菌设备的验证非常关键，可高压灭菌的细胞培养基在121℃、15 psi、15min的条件下完全可达到灭菌效果及营养成分的最小损失，因此不需将灭菌时间延长。

2．过滤灭菌

大多数细胞培养基采用0.1~0.2μm孔径的微孔滤膜进行过滤灭菌，目前，过滤灭菌法已成为细胞培养基灭菌的常用方法，它可最低限度地减少细胞培养基的营养损失。

九、细胞培养液的储存

细胞培养液的储存条件一般为2~8℃、密闭、避光保存，但要注意如下几点：①过滤后的完全培养液，即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培养液要尽快使用，一般在2~3周内使用完。培养液中的L－谷氨酰胺是不稳定的，温度越高，L－谷氨酰胺降解越快。②灭菌后未加L－谷氨酰胺等添加剂的细胞培养液，一般可在4℃保存6~9个月，也可冷冻保存，用时解冻。③高压灭菌后的细胞培养基应置4℃保存，不能因为其可耐受高温而忽略储存温度。④添加某些生长因子、激素等，可能会改变培养液的储存条件，如温度、时间等方面的要求。