第三节 培养细胞的细胞生物学

体外培养的生物成分无外乎两种结构形式：一是小块组织或称为组织块（Tissue block），一般称为外植块；二是将生物组织分散后制成的单个细胞，一般称为分离的细胞（Isolated cell）或者分散的细胞（Dissociated cell）。分散的过程通常在细胞培养基或平衡盐溶液中进行，分散的细胞被悬浮于细胞培养基或平衡盐溶液中。单个细胞分散存在于细胞培养基或其他平衡盐溶液、缓冲溶液中，称为细胞悬液（Cell suspension）。狭义的细胞培养主要是指分离（散）细胞培养，广义的细胞培养的概念还包括单（个）细胞培养（Single cell culture）。目前，用于医学研究的体外培养细胞基本有3类，即原代细胞、二倍体细胞株及传代细胞系。

一、体外培养细胞的分型

体外培养细胞按照细胞生长过程中是否贴壁分为贴附型细胞和悬浮型细胞两种类型。

（一）贴附型细胞

大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，大致分成以下四型：成纤维细胞型细胞、上皮型细胞、游走型细胞和多形型细胞。常见培养的贴附型细胞形态可参见图1-1。

1．成纤维细胞型细胞

成纤维细胞型细胞的胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈成纤维细胞型状态。培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称为成纤维细胞。

2．上皮型细胞

上皮型细胞的细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独生长。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。

3．游走型细胞

游走型细胞呈散在生长，一般不连成片，胞质常形成突起，呈活跃游走或变形运动状态，方向不规则。游走型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。

4．多形型细胞

有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统一归于多形型细胞。

（二）悬浮型细胞

见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞，胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长，这类细胞容易大量繁殖。

二、培养细胞的生长和增殖过程

体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、培养皿或其他容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。另外，很多细胞在体外的生存也不是无限的，存在一个发展过程。所有这一切使组织细胞在培养中有着一系列与体内不同的生存特点。

（一）培养细胞生命期

培养细胞生命期（Life span of culture cells）是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持一年左右的生存时间，最后衰老凋亡（Apoptosis）。如果供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；如果培养的为其他细胞，如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞整个生存过程中，一般均经历以下3个阶段：原代培养期、传代期及衰退期。

1．原代培养期

原代培养（Primary culture）期也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1~4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。初代培养细胞多呈二倍体核型。由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，所以原代培养期细胞是检测药物很好的实验对象。

2．传代期

初代培养细胞一经传代后便改称作细胞系。在全生命期中，此期的持续时间最长。在培养条件较好的情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称为二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出10代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代10~50次，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期，即衰退期。

3．衰退期

衰退期（Decling growth phase）细胞仍然可以生存，但增殖速度很慢或根本不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。

在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代期末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous transformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获得持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite cell line），也称连续细胞系（Continuous cell line）。无限细胞系的形成主要发生在第二期末或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性。细胞永生性和恶性性非同一性状。

（二）培养细胞的生长曲线

体外培养细胞包括初代培养及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。传代的频率或间隔与细胞培养基的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞在数量大、细胞基数大、相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快，实际上细胞接种数量大时，细胞增殖速度比细胞接种数量稀少时要快。连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增殖快，细胞培养基中血清含量多时细胞增殖比血清含量少时要快。

细胞“一代”是仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代不是同一含义。如某一细胞系为第150代细胞，即指该细胞系已传代150次。它与细胞世代或倍增不同；在细胞一代中，细胞能倍增3~6次。细胞接种入培养瓶后，先进入2~24h的潜伏期，然后进入指数增生期，汇合成单层细胞进入缓慢生长或停滞期。每种细胞系的这些生长期（Growth phase）都是特征性的，只要环境条件保持恒定，每一次测定结果应该是可重复的。细胞传一代后，一般要经过潜伏期、指数增生期和停滞期3个阶段。

1．潜伏期

潜伏期（Latent phase）也叫延迟期（Lag period）。细胞接种培养后，先经过一个在细胞培养基中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、细胞培养基成分和底物的理化性质等密切相关。初代培养细胞贴附慢，可长达10~24h或更多；连续细胞系和恶性细胞系贴附快，10~30min即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利于细胞贴附，底物表面带有阳性电荷则利于细胞贴附。另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素（Fibronectin），又称LETS（Larger external transformation substance），细胞表面蛋白（Cell surface protein, CSP）等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细胞膜的表面如CSP，有的则来自细胞培养基中的血清如LETS。近年又从各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。

细胞贴附于支持物后，除先经过前述延展过程变成极性细胞外，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，细胞可有运动活动，但细胞基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和细胞培养基性质等密切相关。初代培养细胞潜伏期长，一般为24~96h或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6~24h；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。

2．指数增生期

指数增生期（Logarithmic growth phase）又叫指数生长期（即对数期），是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数（Mitotic index, MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、细胞培养基成分、pH值、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数介于0.1%~0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%~5%。pH值和细胞培养基中血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3~5d后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，则细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（Contact inhibition）。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与肿瘤细胞标志之一。肿瘤细胞由于无接触抑制，能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（Piled up）。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，细胞培养基中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的减少和代谢物增多的影响，则发生密度抑制（Density inhibition），导致细胞分裂停止。因此细胞接触抑制和密度抑制是两个不同的概念，不应混淆。

3．停滞期

细胞数量达饱和密度后，细胞就停止增殖，进入停滞期（Stagnate phase）。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（Plateau）或平台期（Plateau phase）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而细胞培养基中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH值降低。此时需要进行分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，甚至细胞会从底物脱落而死亡，故传代应越早越好。传代过晚能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传1~2代，通过更换细胞培养液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。