实验二 蠕虫虫卵培养及幼虫分离技术
【实验目的】
掌握蠕虫虫卵培养及幼虫分离技术，认识常见线虫幼虫和吸虫毛蚴等蠕虫幼虫的一般形态特征。
【实验内容】
1．蠕虫虫卵培养技术。
2．毛蚴孵化技术。
3．幼虫分离技术。
【材料与设备】
载玻片、盖玻片、平皿、培养皿、镊子、烧杯、放大镜、漏斗、漏斗架、胶帽吸管、试管、玻璃管、玻璃棒、滤纸、纱布、脱脂棉、40～60目铜筛、三角烧杯、胶塞、长颈平底烧瓶、贝尔曼装置（乳胶管两端分别连接漏斗和小试管）、普通温箱、光学显微镜等。
【操作与观察】
一、蠕虫虫卵培养技术
有些蠕虫虫卵（如圆线目大部分线虫）在形态上非常相似，难以鉴别，需要在外界一定温度和湿度条件下进行第三期幼虫的培养，然后根据幼虫的形态特征进行种类鉴定，从而达到确诊或进行科学研究的目的。
操作方法：取适量新鲜粪便置于培养皿（底部加一张滤纸）内，加水调成硬糊状（如粪便稀则不必加水），塑成半球形，顶部略高出培养皿，加上皿盖，使粪便与皿盖接触。然后置于25～30℃温箱内培养，注意保持培养皿内湿度（保持滤纸潮湿状态）。经7～15d后，多数虫卵即可发育成为第三期幼虫（图2.1），并集中于皿盖上的水滴中，将幼虫吸出置于载玻片上，加盖玻片用显微镜检查。
图2.1 马属动物圆线虫第三期幼虫（引自秦建华、李国清，2005）
1．马圆线虫2．普通圆线虫3．无齿圆线虫4．小型圆线虫
二、毛蚴孵化技术
毛蚴孵化法是目前我国疫区检查家畜血吸虫的主要方法，也是国家考核达标验收时规定的检查方法。其原理是将含有血吸虫卵的粪便在适宜的温度条件下进行孵化，毛蚴孵出后，借着毛蚴向上、向光和向清的特性，进行观察，做出诊断。该法具有样本采集方便、方法成本低、检查结果可靠等优点。
1．顶管孵化法（图2.2）：取粪便50～100g，放入烧杯内用玻璃棒捣碎，加清水250～500mL，搅拌均匀，通过40～60目铜筛滤入另一烧杯内，加水至九成满，静置沉淀（每次约30min），之后将上清倒掉，再加清水搅拌均匀，沉淀，如此反复操作3～4次。然后将反复淘洗的粪渣倒入三角烧瓶，加入25℃的温水，塞入中央插有玻璃管的胶塞，其中加水量以插入的玻璃管内露出一段水柱为准。最后放入25℃温箱中孵化，孵化30min后开始用放大镜观察水柱内是否有毛蚴，如没有，则每隔1h再观察一次，直到发现毛蚴即可停止孵化。
图2.2 顶管孵化法装置（引自Yang,2005）
2．棉析法（图2.3）：取50～100g粪便，经上述方法反复淘洗、沉淀、换水后（不淘洗也可），将粪渣移入500mL的长颈平底烧瓶内，然后加入25℃的温水，瓶口塞入薄层脱脂棉，加水至棉层上方10mL左右，最后置于25℃温箱中孵化。孵化半小时后开始用放大镜观察棉层上面水中是否有毛蚴，如没有，则每隔1h再观察一次，直到发现毛蚴即可停止孵化。
图2.3 棉析法装置
1．清水层2．脱脂棉3．浊水层4．粪渣
样品孵化后，经1、3、5h各观察1次，检查有无毛蚴的出现。毛蚴的观察应在光线明亮处衬以黑色背景用肉眼观察，必要时可借助放大镜。毛蚴为淡白色、折光性强的菱形小虫，多在距水面4cm的水内呈平行或斜行方向做直线运动。在显微镜下观察时可见毛蚴呈前宽后窄的三角形，前端有一突起，周身有纤毛（图2.4）。观察时应注意与水生动物相区别。
图2.4 血吸虫毛蚴
三、幼虫分离技术
幼虫分离技术通常采用贝尔曼幼虫分离技术，其原理是利用多数线虫幼虫受重力作用而不能移动，在一个没有表面张力的水体内会逐渐下沉的特点。贝尔曼法可用于分离和浓集粪便、组织碎片和土壤样品中的线虫幼虫。
操作方法：首先连接贝尔曼装置（图2.5），即用一根乳胶管两端分别连接漏斗和小试管，然后置于漏斗架上。将粪便样品（5～15g）捣碎，放置于一个滤茶器或包裹于粗棉布内，然后在漏斗里加入温水。温热可以刺激幼虫的活力，许多幼虫就会来到粪团的表面并分离，向下流至弹簧夹处。在严重感染情况下，大约经一个小时后幼虫便可移至水滴中。但是当只有少量幼虫存在时，必须将贝尔曼装置放置过夜再进行观察。如果取1滴以上的水进行检查，有必要对样品进行离心，去上清，然后用吸管吸取一滴管底的沉淀物进行镜检。目前，许多学者对该技术进行了优化和改良，但基本原理相同。
图2.5 贝尔曼幼虫分离装置（引自鲍曼等，2013）
线虫幼虫的形态见图2.6。
图2.6 分离的广州管圆线虫幼虫（10×10）（引自刘敏，2008）
【注意事项】
1．虫卵培养法：在虫卵培养过程中，应使培养皿内保持一定的湿度和温度。
2．毛蚴孵化法：被检粪便务必新鲜，不可触地污染；洗粪容器不宜过小，免得增加换水次数，影响毛蚴早期孵出；换水时要一次倒完，避免沉淀物翻动，如有翻动，须等沉淀后再换水；孵化用水一定要清洁，自来水须放置过夜脱氯后使用；所有与粪便接触过的用具，须清洗后再沸水烫泡，方可再用。另外，多畜检查时，须做好登记，贴好标签，避免混乱。
3．幼虫分离法：凡是检查组织器官材料，应尽量撕碎；但检查粪便时，则将完整粪球放入，不必弄碎，以免粪渣落入小试管底部，镜检时不易观察。温水必须充满整个小试管和乳胶管，并使被检材料浸泡其中（使水不致流出为止），中间不得有气泡或空隙。为了静态观察幼虫形态构造，可用酒精灯加热或滴入少量碘液，将载玻片上的幼虫杀死。
【思考题】
1．蠕虫虫卵培养技术可用于什么？
2．幼虫分离技术可用于什么？其原理是什么？
3．毛蚴孵化法常用于哪种寄生虫病的诊断，其原理是什么？
【实验报告要求】
1．记录各检查技术的粪检结果。
2．简要叙述各项技术的主要原理和方法。