实验三 蠕虫学虫卵计数及测微技术
【实验目的】
掌握蠕虫学常用的虫卵计数及测微技术。
【实验内容】
1．麦克马斯特氏法。
2．斯陶尔氏法。
3．测微法。
【材料与设备】
载玻片、盖玻片、镊子、塑料杯或纸杯、胶帽吸管、玻璃棒、玻璃珠、量筒、烧瓶、粪筛、麦克马斯特氏计数板、显微镜测微器、光学显微镜、饱和食盐水、0.1mol/L（或4%）NaOH溶液、家畜新鲜粪便。
【操作与观察】
一、麦克马斯特氏法
麦克马斯特氏计数板由两片载玻片组成，上面的较下面稍窄；窄的玻片上有两个1cm×1cm的正方形刻度区，每个正方形又平分为6个长方格。两玻片间垫有几个1.5mm厚的玻璃条。这样就形成了两个0.15mL的计数室（图3.1）。
图3.1 麦克马斯特氏计数板示意
操作方法：取2g粪便放入装有玻璃珠的烧瓶内，加入58mL饱和食盐水振荡混匀，用粪筛过滤，滤液摇晃混匀后立即吸出少量滴入计数室内，静置于显微镜台上，几分钟后用低倍显微镜计数两个计数室内的虫卵，取平均值，再乘以200，可得到每克粪便虫卵数（EPG）。
二、斯陶尔氏法
向特制的烧瓶（瓶颈部有56mL和60mL两个刻度）或其他标好56mL和60mL刻度的试管或三角瓶内加入0.1mol/L（或4%）NaOH溶液至56mL处，加入捣碎的粪便至液面达60mL处。加入十多个玻璃珠振荡混匀粪液，立即用吸管吸取0.15mL于载玻片上，盖以不小于22～40mm的盖玻片，于显微镜下进行虫卵计数（若没有大盖玻片，可以用若干小盖玻片代替）。计数虫卵数乘以100可得到1mL粪便的虫卵数。因为粪便性状影响估算结果，所以1mL的虫卵数再乘以粪便性状系数即为每克粪便中所含的虫卵数。半成形粪便乘以1.5，软湿粪便乘以2，粥样粪便乘以3，水样粪便乘以4。
目前，以上两种方法为兽医蠕虫学虫卵定量计数最常用的方法，操作简便，设备要求简单，适合临床推断家畜体内某种寄生虫的数量和检查药物驱虫效果。麦克马斯特氏法对粪便稀释度大，被检容积小，容易造成漏检，且只适用于可被饱和盐水浮起的各种虫卵计数。各种蠕虫卵的比重见表3.1。
表3.1 蠕虫卵的比重
斯陶尔氏法计数较慢，较为耗时。该方法在每克粪便中虫卵数高于1000个时准确度高，低于500个时误差较大。
三、测微法
显微镜测微器由目镜测微尺和物镜测微尺组成。目镜测微尺为可放在目镜里的圆形小玻璃片，中央刻有100等份的小格（图3.2），这些小格在镜下没有绝对长度的意义，是随着目镜和物镜倍数的不同及镜筒的长短而变化的。物镜测微尺为特制的载玻片，其中央有一黑圈（或是一个圆玻璃片，上有黑圈），圈的中间有一长为1mm的横线，被平分为100格，每格长度为0.01mm（图3.3），这是绝对长度。
图3.2 目镜测微尺刻度，100个小格
图3.3 物镜测微尺刻度，100小格=1mm
操作方法：将目镜测微尺放于目镜内，物镜测微尺放于载物台上；先用低倍镜观察，调节焦距，使目镜测微尺和物镜测微尺的零点对齐，再寻找两者较远端的另一重合线，算出目镜测微尺的几格相当于物镜测微尺的几格，从而计算出目镜测微尺上每格的长度。取下物镜测微尺，换上需要测量的虫卵玻片标本，一般测量虫卵的最长和最宽处（图3.4），圆形虫卵则是测量直径。
为了方便计算，可将目镜测微尺在固定显微镜和固定倍数物镜下的0～9格长度算好，记录下来。如没有物镜测微尺，可用血球计数板来代替使用。
图3.4 测微尺测量虫卵示意（引自Thienpont,1986）
【注意事项】
1．虫卵计数时，所取粪便要求新鲜，不能有土和草等杂质；吸取粪液时必须混匀并在一定的深度吸取。镜检时，不能有重复和遗漏。
2．为了减少每昼夜寄生虫排卵不均衡所造成的虫卵计数不准确，最好在每日的不同时间检查3次，连续检查3d，然后取其平均值。每日排卵量为每克粪便虫卵数乘以24h内粪便总量所得值，将该值除以已知成虫每日排卵数，即可得出雌虫的大约数量。
3．虫卵测量时，某个显微镜测出的目镜测微尺每格的长度只适用于该显微镜一定的目镜倍数和物镜倍数。使用油镜时，必须在物镜测微尺上加盖玻片后再测量，以免损坏刻度线。
【思考题】
1．每克粪便虫卵数量是否反映宿主寄生虫感染程度？
2．在10倍目镜、40倍物镜、镜筒不抽出的情况下，目镜测微尺的44格相当于镜台测微尺的15格（即150μm），则该条件下目镜测微尺的每格长度为多少？此时，取下物镜测微尺，测量具体虫卵，如果测得其长度为24格，其虫卵长度为多少？
【实验报告要求】
1．采用两种虫卵计数方法计数同一份粪样并记录结果。
2．测量2～3种虫卵的大小。