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第四章 19世纪40年代爱尔兰消化性溃疡患者胃内尿素酶的研究
（Humphrey J.O’Connor and Colm A. O’Morain）
一、前言
幽门螺杆菌是唯一一种能够在人体胃部极酸条件下生存、定植并繁殖的独特微生物。幽门螺杆菌非常关键的生物化学特征是它能够合成大量的尿素酶，这也就解释了这种细菌为什么能够在胃内大量繁殖并且能适应胃内极酸微环境的原因。尿素酶能够分解尿素生成二氧化碳和氨，后者可以通过生成铵在细菌细胞周质中起缓冲作用，而且铵还可以中和胃液中的氢离子 ［1］。
最近研究表明，幽门螺杆菌的尿素酶系统不仅有助于细菌抵抗胃酸，而且对细菌在宿主体内的定植也是必需的 ［2］。幽门螺杆菌组成性的合成尿素酶，并占细菌蛋白合成总量的15%。尿素酶检测是一项临床诊断幽门螺杆菌感染的重要方法，例如应用快速尿素酶检测如CLOtest可以对胃黏膜活检组织进行检测， 13C和 14C尿素酶呼气实验是诊断幽门螺杆菌感染的非侵入性诊断方法。
鉴于我们目前对幽门螺杆菌以及肠道疾病的认识，回顾幽门螺杆菌尿素酶的研究历史［特别是爱尔兰科学家Oliver Fitzgerald（1910—1987）教授（图4-1）对这一领域的特殊贡献］，是一件有趣的事情。Fitzgerald教授的一生是辉煌的，他是国际上享有盛誉的消化内科专家，是一名出色的科学家，还是爱尔兰都柏林大学的药物治疗学教授。值得称道的是，他的兄弟Patrick也同样地优秀，时任柏林大学外科学教授，他们共同开创了伟大的历史。在历史上，Bidder和Schmidt于1852年率先报道了胃液中氨的存在（被Fitzgerald和Murphy所引用 ［3］），紧接着Neecki在1896年发现狗胃黏膜中的自由氨浓度要高于其他任何的组织或器官 ［4］。1924年，英国剑桥大学的James Murray-Luck发现门静脉血氨浓度明显高于其他系统，而胃液中的氨浓度要比动脉血氨浓度高50~100倍 ［5］。1925年，Luck和Seth首先发现了脊椎动物胃黏膜中存在尿素酶 ［6］。但是他们却指出，胃黏膜中存在的尿素酶不是由胃内的细菌产生。他们的解释是，实验所用的尿素是溶解于稀盐酸后通过静脉注射至动物体内的，所以能够分解尿素产氨的尿素酶应该是胃黏膜细胞的组成成分。然而有趣的是，Luck和Seth准备的小肠黏膜组织溶解液并不能够分解尿素。Fitzgerald可能就是在1937年于剑桥大学生理学实验室做研究生期间，接触到了尿素酶的相关研究。
图4-1 Oliver Fitzgerald教授（1910—1987）
Fitzgerald回到都柏林开展临床和研究工作后，就与都柏林大学生理学系的同事们着手研究消化性溃疡患者胃中的尿素酶 ［3］。他们前瞻性地假设，消化性溃疡疾病的深层次发病机制在于胃的分泌、中和与黏膜抵抗三者平衡的病理性失调。他们同时也认为，胃黏膜产生氨的机制可能对胃的正常和病理生理功能都具有很重要的意义。
二、不同生物种类的胃尿素酶
Fitzgerald最初的研究方向主要是证实不同种类的动物胃中有尿素酶的存在，以及尿素酶在胃内不同部位的分布。Fitzgerald教授的研究方法看起来有点老套，他将胃黏膜标本脱水处理成粉末后溶解于生理盐水中，然后加入同等体积的1%尿素溶液，混合一定时间后通过检测氨的产量来确定尿素酶的活性。Fitzgerald教授实验中使用的胃黏膜来源于当时消化性溃疡患者胃大部切除术后的标本。
Fitzgerald和他的同事们发现，胃尿素酶在他们所检测的所有动物中普遍存在。此外，他们还发现尿素酶在人、狗和猫的胃内含量，高于其在兔子、猪和大鼠胃内的含量。例如，猫胃中的尿素酶能产生足够的氨来中和猫胃中的胃酸。尿素酶活性主要集中在胃黏膜浅表层，而不是深层。高水平的尿素酶活性也主要存在于胃基底部和幽门部，而小肠部位几乎检测不到尿素酶的活性。
爱尔兰的研究小组也探索了影响胃黏膜内尿素酶含量的因素 ［7，8］。通过一系列的动物实验发现，喂饲高蛋白肉类的猫胃黏膜内的尿素酶含量明显高于喂饲牛奶组，而十二指肠内的尿素酶含量无变化。另外，喂饲黄豆饲料的大鼠胃内的尿素酶含量也明显高于喂饲标准饲料组。在19世纪40年代，浓缩的孕尿被认为富含尿胃抑素和（或）其他的活性成分，它们能够增强实验动物对胃黏膜溃疡的抵抗力。有趣的是，注射浓缩孕尿的大鼠其胃尿素酶含量明显高于注射蒸馏水组。最后，因为尿素是蛋白质代谢的主要终产物，Fitzgerald课题组通过给动物喂饲尿素来分析高蛋白饮食是否会对动物胃内尿素酶的浓度产生影响。该实验结果表明喂饲尿素的大鼠其胃黏膜内尿素酶的含量明显增高。上述尿素酶的动物实验结果为后来针对消化性溃疡患者的治疗性研究提供了基础。
三、尿素与胃酸的关系
Fitzgerald教授和他的同事们假设，如果尿素—尿素酶系统对胃黏膜中碱性物质的生成非常重要，那么通过增加黏膜中的底物（尿素），应该可以降低胃酸的浓度。为了验证这一假说，他们纳入了49例试验参与者（包括健康人群和消化性溃疡患者），并对受试者进行了一系列的研究。受试者分别在口服15g尿素（溶于甜橙味的胶体糖浆中）前后于皮下注射组胺，并随后对其胃酸的分泌进行测定以观察其水平变化，即双重组胺刺激胃分泌试验 ［3］。
在口服尿素后，受试者胃液中的胃酸含量在所有分泌期都显著下降（平均值约为40mEq）。然而，胃酸的降低与胃酸分泌的基础水平并不成比例，表明其并不是通过直接影响胃酸的生成而起作用的，而是通过中和已经产生的胃酸而实现的。正常人在首次和第二次组织胺刺激胃分泌试验中，胃酸的平均降低值为34，而胃溃疡患者一般为54，十二指肠溃疡患者通常为36。不同试验对象对尿素刺激后胃酸分泌反应的不同可能是由于胃酸分泌能力的个体差异所导致，但是Fitzgerald教授同时认为个体尿素酶浓度的差异也可能是原因之一。
在上述试验中，研究人员对受试者的血尿素水平也进行了检测，并发现受试者的胃酸水平和血尿素浓度呈现明显的负相关（图4-2）。他们同时也发现，胃液中的氨含量和胃内的酸度呈负相关，但是胃内氨的增加并不能充分解释胃液酸度的降低。胃溃疡患者胃液中氨浓度的均值要高于十二指肠溃疡患者或者健康人群。试验结果也显示，血氨水平和胃液中的氨浓度呈现极强的正相关（图4-3），这再一次支持了Fitzgerald的观点，即胃液中的氨是由胃黏膜内的尿素酶水解尿素生成的。
图4-2 胃酸和血尿素浓度呈负相关。（●）十二指肠溃疡患者，（+）胃溃疡患者和正常人（该图经许可转载自Fitzgerald O，Murphy P. Irish Med J 1950；292：97-159）
图4-3 胃液氨浓度和血尿素浓度呈正相关（该图经许可转载自Fitzgerald O，Murphy P. Irish Med J 1950；292：97-159）
这项研究中的两例研究对象在接受5%尿素（生理盐水配制）的静脉注射后，出现了胃酸水平的显著下降，然而其胃内氨的浓度只出现了轻微上升。Fitzgerald及其同事们对这一矛盾的现象疑惑不解，为什么伴随着胃酸降低，胃黏膜内的氨会增加？他们推断，分泌到胃的氨与胃酸发生中和的位置应该是在胃壁而不是胃腔，而且中和后的产物可能会被重新吸收。为了验证这个推断，他们进行了一系列具有创意的中和实验。他们将猫胃取出，在猫胃的贲门处连接试管向胃内灌注稀盐酸，然后分别将两个采样试管通过胃壁插入到胃腔和胃黏膜的表面（图4-4）。在所有的实验中，从胃黏膜表面采集的样品酸含量要低于从胃腔中采集的样品。在这些实验中并没有使用尿素，但是问题在于，胃黏膜内氨的水平不足以解释胃酸最终中和的程度。
图4-4 猫胃分离后插入样本采集管的示意图（该图经许可转载自Fitzgerald O，Murphy P. Irish Med J 1950；292：97-159）
四、消化性溃疡治疗中尿素的使用
19世纪40年代，消化性溃疡的临床治疗是不理想的，其主要的治疗手段是长时间卧床休息和碱性牛奶的饮食治疗。作为一名临床医生，Fitzgerald教授特别期望能够发现一种新的有效方法来治疗消化性溃疡，正是这个愿望促使他开展了胃尿素酶的研究。Fitzgerald教授的研究小组认为尿素—尿素酶系统是胃黏膜的组成部分之一。基于以上假设，以及在动物和人体上的实验结果，他们认为激活尿素—尿素酶系统应该可以保护胃黏膜，中和胃酸，从而达到治疗消化性溃疡的目的 ［9，10］。当然，现在看来，通过激活尿素酶活性的方法是很讽刺的，因为治疗消化性溃疡的根本方法是根除幽门螺杆菌从而使胃尿素酶的活性降低，而不是激活其活性。但更具讽刺性的是，40年后幽门螺杆菌的发现不是在都柏林，而是在澳大利亚 ［11］。
通过给消化性溃疡患者口服尿素，Fitzgerald教授和他的同事们的目标是使胃内和血中的尿素含量增加，以增加胃尿素酶的底物。在这项试验中，他们使用的尿素口服液含有15g尿素（溶于鲜橙或者柠檬汁风味的胶体糖浆中）。“这是一种相对可口的混合物，但是很明显不是一种可以称得上爽口的液体”。一些患者发现这种溶液难以下咽，但是大部分试验对象能够忍受这种味道。实验一共纳入62例患者（包括胃溃疡、十二指肠溃疡还有吻合处溃疡患者），并且他们在整个治疗过程中是未被限制活动的 ［3］。在这项研究中，所有的患者均进行了钡餐造影检查，Fitzgerald教授还亲自对那些有胃溃疡或者吻合处溃疡的患者进行了胃镜检查。由于每人每周尿素的使用量最高达到500g，有时候尿素的供应就是一个问题。1949年，尿素的供应问题在两国贸易争端的时候尤为紧张，甚至有一段时间英国对爱尔兰实施尿素的禁运！
这项治疗研究的结果见表4-1。约80%的患者在口服尿素后临床症状有所减轻，而且相当一部患者的临床症状完全消失。口服尿素能够快速缓解胃溃疡病例的临床症状，对十二指肠溃疡症状的缓解则要缓慢一些，而吻合处溃疡患者对口服尿素治疗的反应通常与胃溃疡患者相近。双重组织胺刺激试验中胃酸水平的变化能够预测患者对尿素治疗的反应（尽管有几例患者的双重组织胺刺激结果理想，但是实际的尿素治疗效果却并不尽如人意）。Fitzgerald教授认为其他一些因素，如心理精神疾病和结肠痉挛综合征或者可以解释临床出现的这些偏差。
表4-1 应用尿素治疗62例患有不同程度消化性溃疡患者的结果总结
极好，患者或者在持续治疗后没有任何临床症状或者本身就没有任何临床症状；好，患者明显好转，但是还有部分临床症状；一般，尿素治疗后临床症状暂时性轻微改善；差，临床症状没有改善
在这项研究中，尿素的常规使用剂量是每次15g，每天5次，但是对于难治性患者，剂量也会加大。这项研究也尝试通过监测空腹血中尿素的浓度来调节尿素剂量的大小，目标是维持血中尿素的浓度在60~80mg，因为尿素浓度大于80mg后会出现副作用，如头痛、恶心和食欲下降。考虑到消化性溃疡的易复发性，尿素治疗的疗程至少是6个月的时间，但是这项研究并没有评估尿素对预防消化性溃疡的复发是否有效。
Fitzgerald教授坦率地承认，如果想要证实尿素治疗方案是否有效，必须设立相应的对照组 ［7］。由于种种原因，该研究并没有设置适当的对照组。首先，该项试验的参与者一般为难治性患者，在入组前往往已经接受过很多不同形式的治疗；其次，很难找到和尿素口感相近的物质作为对照。他们尝试使用奎宁作为尿素的对照，但由于奎宁具有很强的胃刺激性而不适用。他们同时也承认尿素治疗方案在临床上的可操作性不足，例如治疗的剂量不易掌握，剂量的重复次数不易控制，尿素不适于口服给药，而且还可能需要监测血中尿素浓度。基于以上种种考虑，Fitzgerald教授和他的同事们最终得出的结论是尿素治疗不可能成为治疗消化性溃疡的常规方法。
五、胃尿素酶的来源：黏膜还是细菌？
Fitzgerald教授关于胃尿素酶在健康和疾病中作用的基本假设为：尿素酶系统是脊椎动物胃内固有的，而并不是来源于感染的能够分解尿素的细菌。如果胃中的尿素酶被证实是来源于感染的细菌，那么他们关于胃尿素酶能够保护胃黏膜并且中和胃酸的整套理论将变得毫无意义。19世纪50年代初期，有论文提示胃尿素酶的来源应该是胃内感染的细菌。Dintzis和Hastings给予小鼠胃肠道大剂量的青霉素、土霉素和磺胺胍后，发现小鼠胃黏膜内的尿素酶活性在两天之内消失 ［12］。在另一个类似的实验中，Kornbergh和Davies观察到在联合使用大剂量的青霉素、土霉素和璜胺胍后，猫胃肠道内细菌在停止生长的同时胃尿素酶的活性也消失了 ［13］。
受以上实验结果的鼓励和引导，Conway、Fitzgerald教授及同事详细研究了小鼠模型中胃尿素酶的位置和来源 ［14］。在该实验中，他们将显微管插入胃黏膜细胞内，取出细胞质检测其尿素酶活性并进行细菌培养。同时，他们将胃内、口腔和食管的冲洗液也进行细菌培养，并对培养出的细菌进行尿素酶活性检测。这项研究的结果提示胃黏膜的尿素酶似乎存在于胃黏膜上皮细胞的表面，而细胞内并无细菌的存在。小鼠胃黏膜的尿素酶含量相对较高，“这是需要极大数量的细菌来供应的，而由胃内的细菌产生如此大量的尿素是不太可能的”。Conway在论文中引用了Cardin关于胎儿尿素酶的研究报告 ［15］，也引用了在正常情况下胃部菌群的相对贫乏的研究结果，从而认为胃尿素酶的来源不是细菌性的。
六、结论
现在我们终于认识到胃尿素酶来源于幽门螺杆菌，并且也认识到治疗消化性溃疡的关键是完全抑制胃尿素酶活性，而不是Fitzgerald教授所认为的增加其活性。在19世纪80年代，Fitzgerald教授对快速发展的幽门螺杆菌研究依然非常感兴趣，但是在与他交流相关的研究课题时，我们可以明显感觉到他流露出的那种失落感。碰巧的是，我们（本文的两位作者）都是都柏林大学的毕业生，H.J.O’C就是在Fitzgerald教授的研究组完成硕士研究生培训的。基于目前对幽门螺杆菌尿素酶的认识，有的人可能会对Fitzgerald教授课题组的研究工作不屑一顾。但是，他们在对消化性溃疡研究方面的思路，不论是在当时，还是在50年之后的今天，都是具有指导意义的。重新调节患者的胃酸分泌、胃酸中和以及黏膜抵抗三者之间的“相互作用失衡”，是我们目前的重要工作。幽门螺杆菌的发现使这项工作做起来简单了很多。
参考文献
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