3.4　免疫检测技术在食品安全中的应用

免疫检测最初是应用在临床医学上的，现其在食品安全的检测领域也获得了广泛应用，几乎覆盖了所有的食品安全领域。

食品中有害微生物及其毒素的免疫检测：

根据食品中有害微生物及其毒素的不同，其针对的免疫检测方法也不同，而且几乎所有的免疫学方法都可以用于食源性有害微生物的检测与鉴定，其中常用的方法主要包括乳胶凝集法、免疫扩散法、ELISA法、免疫磁珠法以及免疫沉淀法等。下面以对致泻性大肠埃希氏菌肠毒素以及禽流感病毒的快速免疫检测为例来说明免疫分析技术在食品有害微生物及其毒素检测中的应用。

（1）间接抗原竞争ELISA法检测致泻性大肠埃希氏菌肠毒素

①原理　微孔板包被致泻性大肠埃希氏菌肠毒素抗原，加入待测样品和针对致泻性大肠埃希氏菌肠毒素的单克隆抗体，固相的毒素与样品中的毒素竞争性结合单克隆抗体，没有与固相抗原结合的单克隆抗体和游离的样品毒素在洗涤步骤中被除去，再加入酶标记的兔抗鼠Ig与固相上的单克隆抗体结合，将底物（邻苯二胺）加入到孔中孵育，加入反应终止液终止反应后，在492nm处测量吸光度值，吸光度值与大肠埃希氏菌肠毒素浓度的自然对数成反比。

②产毒培养　将菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6mL CAYE培养基内，37℃振荡培养过夜。加入20000IU/mL的多黏菌素B 0.05mL，于37℃离心1h，分离上清液，加入0.1％硫柳汞0.05mL，于4℃保存待用。

③ST检测法

a.包被　先在包被用ST抗原管中加入0.5 mL包被液，混匀后全部吸出于1.6mL包被液中混匀，以每孔50μL 加入40孔聚苯乙烯软反应板中。加液后轻轻敲板，使液体布满孔底。第一孔留空作对照，置4℃冰箱湿盒中过夜。

b.洗板　用洗板液Ⅰ洗3次。

c.封闭　每孔分别加入100μL封闭液，37℃水浴1h。

d.洗板　用洗板液Ⅱ洗3次，操作同上。

e.加样品及ST单克隆抗体　每孔分别加实验菌株产毒培养液50μL，稀释的单克隆抗体50μL（先在ST单克隆抗体管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于1.6mL稀释液中，混匀备用），37℃水浴1h。

f.洗板　用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。

g.加酶标记兔抗鼠Ig复合物　先在加酶标记兔抗鼠Ig复合物管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀，每孔加100μL，37℃水浴1h。

h.洗板　用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。

i.酶底物反应　每孔（包括第一孔）各加基质液100μL，室温下避光5～10min，再加入终止液50μL。

j.结果判断　以酶标记仪在波长492nm下测定吸光度（OD）值：

结果为阳性。

（2）斑点金免疫色谱测定法快速检测禽流感病毒

①原理　将与禽流感病毒相对应的多克隆抗体固定于斑点金免疫色谱试纸条的检测带上，用胶体金标记与禽流感病毒相对应的单克隆抗体，并干燥于试纸条的金标垫上，再将羊抗鼠IgG固定于检测带后方的质控带上。检测时，将待测样品加于样品垫上后，样品由于毛细管扩散作用向前移动，首先经过金标垫并水化干燥的胶体金标记物。样品中的禽流感病毒与被胶体金标记的单克隆抗体发生特异性结合后，继续向前移动到达检测带，此时被间接标记的禽流感病毒再次与检测带上的多克隆抗体发生特异性结合，从而使免疫复合物被富集或截留在检测带上，使检测带呈现红色。未与禽流感病毒结合的金标抗体继续色谱分离至质控带与羊抗鼠IgG发生特异性结合，同样使质控带呈现红色。通过肉眼判断检测带与质控带的显色情况，可判断样品是否为阳性。

②胶体金的制备　制备直径为10nm的胶体金。

③胶体金标记抗体　用胶体金标记抗禽流感病毒的单克隆抗体（鼠源）。

④胶体金免疫色谱测定法检测试纸条的组装　将兔抗禽流感病毒的高免血清（多抗）用XYZ3000平台系统喷涂于硝酸纤维膜上反应区（C区）位置，在离反应区5mm处（D区）喷涂抗抗体（羊抗鼠IgG），此为质控区，喷涂后室温干燥2h。将金标抗体喷涂在玻璃纤维上（构成胶金垫），室温干燥2h。将样品垫、胶金垫和吸水纸依次组装在塑料底板上（图3-7），这样便完成快速检测试纸条的组装。

⑤检测样品　试纸条检测卡平放，将样品滴加到检测卡的样本垫上（A区），5min内观察结果。如果反应区及质控区上均出现红色条带，说明样品呈阳性，如果反应区上没有出现红色条带，仅质控区上出现红色条带，说明样品呈阴性。