第二节　乳的热稳定性及其影响因素

已经有很多实验证明，尽管牛乳的热稳定性与乳中存在的各种痕量的盐有关，但并不能说热稳定性与任何已知的要素有关。大量混合的牛乳的化学组成基本相似，但热稳定性却极其复杂，没有一个因素能对其有明显的控制。由一头牛挤出的牛奶虽然每天的组成和热稳定性可能都有所变化，但它的复杂性低于混合牛乳。

为酪蛋白磷酸钙溶液或牛奶提供稳定性的主要因素毫无疑问是水合程度和离子所带的表面净电荷。但这些因素受到多种二级因素的影响，所以不能像其他理想胶体一样给出简单直接的解释。牛奶是一种很复杂的混合物，含有许多有机和无机成分，不能忽略任何一个因素去讨论牛奶的稳定性。但我们可以选择一些对稳定性或不稳定性最有影响的因素进行讨论。如：溶液中的组分、钙、镁离子、磷酸盐离子和可溶性有机磷酸盐、柠檬酸盐离子、氯离子或氯化钠、乳糖、氢离子（pH值）、无机磷酸钙、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、γ-酪蛋白、与酪蛋白发生反应的已热变性的β-乳球蛋白，它们已成为胶束的一部分。

以上所提及的许多组分只有在它们相对其他组分处于最佳浓度时才能促进稳定性。同时各因素的相对重要性还可能依赖于凝固发生的类型（如酶凝固、热凝固）及发生凝固时的环境（如发生在不同pH值水平的酶凝固）。

一、乳蛋白质对热稳定性的影响

（一）酪蛋白对热稳定性的影响

将不同牛所产的牛乳根据热稳定性的不同进行分类，分为A类（有最大和最小热稳定性）和B类（没有最小热稳定性）。加拿大的乳中有2/3呈A型，澳大利亚、爱尔兰、苏格兰、荷兰、新西兰的乳中绝大多数是A型。通过添加κ-酪蛋白和β-乳球蛋白可以分别使A型变为B型或B型变为A型。而添加α-酪蛋白或β-酪蛋白却不能改变牛奶的热稳定性类型。添加κ-酪蛋白不能影响牛奶在90℃加热10min时的热稳定性和pH值的关系。研究表明，热变性的β-乳球蛋白和κ-酪蛋白之间的反应是影响大多数牛奶的综合热稳定性和pH值关系的主要因素。但是关于β-乳球蛋白或κ-酪蛋白的含量与热稳定性-pH关系图之间的直接关系还没有建立。Tessier等人（1964）的研究表明酪蛋白磷酸钙胶束的表面组成是必须考虑的因素。向A型牛奶（在热稳定性-pH曲线上有最大值和最小值）添加κ-酪蛋白可以降低或彻底消除最小值。由于加入κ-酪蛋白并不能破坏酪蛋白磷酸钙胶束，所以可以得出结论，表面酪蛋白影响热稳定性-pH曲线；而B型牛奶（在热稳定性-pH曲线上没有最小值）的胶束表面有过剩的酪蛋白。根据这个推断，用NaCl处理B型牛奶，去除其表面的κ-酪蛋白可以使其转变为A型牛奶。同理，添加β-乳球蛋白可以使A型牛奶转变为B型。因此，热稳定性-pH的曲线是由κ-酪蛋白和β-乳球蛋白的比例决定的。可以推测当牛奶加热时，变性的β-乳球蛋白与自身、可溶性的酪蛋白和暴露在胶束表面的酪蛋白发生反应。因此，这些成分的比例影响了热稳定性-pH曲线，同时那些影响变性的β-乳球蛋白与其他非酪蛋白分子发生分子反应的因素也会影响这条曲线，如加热的速度和温度。尽管当牛奶加热至140℃时，充足的表面κ-酪蛋白使牛乳表现为B型，但在90℃预热可能促进β-乳球蛋白和胶束表面的κ-酪蛋白的复合反应，这样就保证了牛奶表现为A型。在某一特定的牛奶中酸性酪蛋白中κ-酪蛋白含量与胶束表面的κ-酪蛋白的数量（从热稳定性-pH曲线上得出）没有一定的关系。选用κ-酪蛋白含量高的胶束比低κ-酪蛋白含量的胶束能提供更多的表面κ-酪蛋白，也就是说更可能成为B型。这两种胶束主要不同在于非有机磷酸钙含量不同，这可能也影响了它们的表面性质。Fox和Hearn通过凝乳酶水解κ-酪蛋白的方法证实了κ-酪蛋白在pH≥6.9时对乳的热稳定性有重要影响。

在乳浓缩前添加κ-酪蛋白可在整个pH值范围内提高浓缩乳的热稳定性，在脱脂乳中添加α_s2-酪蛋白，不影响最大稳定性而减弱了pH≥6.9时的乳稳定性。由添加α_s1-酪蛋白、β-酪蛋白而增加的合成胶束的热稳定性随pH值的增加而增加，据此可知B型乳的热稳定性不仅依赖于κ-酪蛋白与β-乳球蛋白的比例，也和α_s1-酪蛋白、β-酪蛋白间的比例关系密切，若去除β-酪蛋白则乳表现为A型乳。

Singh和Fox（1987）认为β-乳球蛋白含量大于0.8%的情况下，加热无酪蛋白胶束血清蛋白分散液（SPFCM）形成的凝固物或主要包括α_s1-酪蛋白、α_s2-酪蛋白或β-酪蛋白和相对很少的κ-酪蛋白的凝胶。酪蛋白胶束的稳定性主要是由κ-酪蛋白外伸的C-末端的位阻效应形成的，这些末端也赋予了胶束一个较高的表面电荷（-20mV）。从酪蛋白胶束中释放出胶束态酪蛋白-β-乳球蛋白复合物可能削弱了κ-酪蛋白的外伸的C-末端的位阻效应带来的稳定作用（这可能是主要的胶束稳定因素），显著诱导了在Ca^2＋存在下无酪蛋白的胶束的聚集；胶束的Zeta电位也可能由于去除了κ-酪蛋白而降低。

阴离子和阳离子洗涤剂对于热稳定性和凝乳酶凝固方面的作用显然表明表面电荷对于胶束的稳定性有重要的意义。十二烷基磺酸钠（SDS）对于热稳定性的作用与β-乳球蛋白类似，这是由于SDS增加了胶束的净负电荷；因此Shalabi和Fox认为β-乳球蛋白像SDS一样是通过增加胶束的净负电荷而增加了酪蛋白的稳定性。图2-14显示增加β-乳球蛋白的数量就增加了pH6.7时酪蛋白胶束的水化程度，而可能使体系稳定。如果增加表面电荷和水化程度的假设成立，则胶束的稳定假设也可以成立。β-乳球蛋白-κ-酪蛋白复合物对酪蛋白胶束的稳定作用依赖于温度、pH值、Ca^2＋浓度。但在一定的pH值范围内，这种复合物使酪蛋白胶束不稳定，因为当pH≥6.9时，它促进了胶束表面的酪蛋白的释放，因此降低了胶束的电荷、水化程度和稳定性。

1.总蛋白浓度的影响

Andrew等（1999）研究了蛋白质浓度改变对单一乳清蛋白变性速率的影响。通过超滤将脱脂牛奶中总蛋白的量增加到两倍，向脱脂牛奶中额外添加超滤液使蛋白质浓度减小到四分之一。以pH4.6时溶解性损失来测定总乳清蛋白变性速率，结果发现，当总蛋白浓度增加时，变性速率增加；总蛋白浓度下降时，变性速率下降。80℃加热时，免疫球蛋白迅速变性，浓度对变性速率的影响不能测定。其他三种主要乳清蛋白质组分（血清白蛋白/乳铁蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白）的变性速率随总蛋白浓度增加而增加。以前的研究表明，乳清蛋白的变性敏感性为：免疫球蛋白＞血清白蛋白/乳铁蛋白＞β-乳球蛋白＞α-乳白蛋白。

2.酪蛋白浓度的影响

Andrew（1999）将脱脂牛奶酸滤后重新调整pH值至6.7，然后再加回到脱脂牛奶中，这样降低了酪蛋白的浓度而乳清蛋白浓度不变。在进一步的实验中，离心脱脂牛奶获得酪蛋白，然后又加回到脱脂牛奶中，这样增加酪蛋白的浓度而乳清蛋白浓度不变。实验表明随着酪蛋白的浓度在脱脂牛奶中的增加，总乳清蛋白变性速率增加。随着酪蛋白浓度加到大约脱脂牛奶水平的三分之一，β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的起始变性速率很快。在这个浓度以上，变性速率增加很少。同样，将脱脂牛奶中酪蛋白胶束的浓度翻倍，而保持乳清蛋白浓度不变，β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的变性速率只有少量增加。乳清蛋白的变性水平不受酪蛋白胶束浓度增加的影响。但当酪蛋白的浓度降至小于脱脂牛奶的三分之一后，乳清蛋白变性的速率显著下降。

（二）乳清蛋白（特别是β-乳球蛋白）对热稳定性的影响

单一乳清蛋白的变性速率随总蛋白浓度的增加而增加，并与乳清蛋白的浓度有较小的相关。乳清蛋白主要对乳热稳定性的pH值依赖关系产生影响。将β-乳球蛋白添加于去乳清蛋白的酪蛋白胶体中，若添加量＜0.6g/L对热稳定性无影响，若添加量达0.6～3.6g/L、则pH6.5～6.7时增加稳定性，在强碱性区域稳定性下降。Rose（1962）的研究表明，热变性的β-乳球蛋白和κ-酪蛋白间通过二硫键作用，从而影响乳热稳定性的pH值依赖关系。Fox和Hearn发现α-乳白蛋白对乳热稳定性的影响和β-乳球蛋白相似。血清白蛋白、溶菌酶使乳热稳定性下降，研究表明，这种对热稳定性的破坏作用也有二硫键形成的参与。浓缩乳热稳定性随着乳清蛋白的添加而下降，浓缩乳热稳定性和pH值间的曲线形状没有变化。

Rose（1962）通过实验发现，最大和最小的热稳定性都与β-乳球蛋白的含量显著相关（相关系数分别为0.50和-0.52）。非有机成分及其比例与最大热稳定性并不相关。实验结果表明变性的β-乳球蛋白-酪蛋白混合物（或κ-酪蛋白）是热敏性的组分。

已有大量研究证实，热变性的β-乳球蛋白和κ-酪蛋白之间的反应是影响大多数牛奶的综合热稳定性和pH值关系的主要因素。但这些组成对热稳定性影响的定量关系尚未确定。只能推测当牛奶加热时，变性的β-乳球蛋白与自身、可溶性的酪蛋白和暴露在胶束表面的酪蛋白发生反应，这些成分的比例影响热稳定性-pH曲线。同时影响β-乳球蛋白与其他分子反应的其他因素也影响乳的热稳定性。

Singh和Fox（1987）认为β-乳球蛋白在加热的牛奶中扮演两个不同的角色：它和酪蛋白的聚合防止了酪蛋白胶束在pH6.5～6.7的热致沉淀；而当pH＞6.9时，它促进了胶束态酪蛋白的解离而降低了水化程度和可能的Zeta电位，因此使酪蛋白胶束不稳定。

Andrew等人（1999）通过加入冷冻干燥的乳清蛋白使脱脂牛奶中乳清蛋白浓度增加到原来的2.5倍。随着脱脂牛奶中乳清蛋白浓度增加，总乳清蛋白变性的相对速率也增加。80℃加热时，在所有乳清蛋白浓度下，免疫球蛋白都快速变性，因此不能测定它们变性速率的增加。但血清白蛋白/乳铁蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的变性速率都随乳清蛋白浓度增加而增加。

Tan-Kintia和Fox（1999）研究了乳清蛋白对预热过的牛奶热稳定性的影响，图2-15的结果显示在pH6.6或pH7.0，90℃预热牛奶10min，将使牛奶的HCT-pH曲线发生漂移，在120℃、125℃或130℃测试热稳定性时，发现HCT的最大值和最小值都下降了。升高测试温度则不稳定影响降低，在40℃时达到一个很小值。在pH7.0预热比在pH6.6预热时HCT的最大值向更低的pH值漂移。

相反，对于去酪蛋白胶束血清分散液（SPFCM）而言，在130℃或140℃预热都有稳定的作用。对于综合的牛奶样品（SPFCM中含有5mmol/L尿素、130mmol/L乳糖和0.35%β-乳球蛋白），如果在预热过程中不含β-乳球蛋白则预热有稳定的作用，若含有β-乳球蛋白则有一个不稳定的作用，这个效果在130℃测试时更明显。当用半乳糖和葡萄糖替代乳糖时，HCT的最小值消失；但若有β-乳球蛋白存在，情况就不是这样的。因此预热造成的不稳定现象是由于β-乳球蛋白产生的（也许还有其他乳清蛋白）。

（三）酪蛋白和乳清蛋白相互作用对热稳定性的影响

我们已经知道，热变性的β-乳球蛋白和κ-酪蛋白之间的反应是影响大多数牛奶综合热稳定性和pH值关系的主要因素，但具体关系尚未明确。

Singh和Fox（1987）的研究表明，在90℃加热含有β-乳球蛋白的酪蛋白胶束体系10min，当pH＜6.9时，β-乳球蛋白和酪蛋白胶束通过巯基-二硫键反应形成复合物，超速离心时形成共沉淀。这种复合物可以防止酪蛋白胶束在加热时解离。但当pH≥6.9时，β-乳球蛋白和酪蛋白的复合物在加热时解离，增加了κ-酪蛋白胶束的释放。在pH7.3时高浓度的β-乳球蛋白（含量≥0.8%）促进了κ-酪蛋白胶束的解离而降低了聚集。这表明α_s1-酪蛋白、α_s2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白以相同的程度从血清蛋白中的游离酪蛋白胶束中解离，但β-乳球蛋白的存在特别增加了pH≥6.9时κ-酪蛋白的解离。pH6.7、β-乳球蛋白存在的情况下加热酪蛋白胶束可微微增加胶束的水化，而在pH7.3时β-乳球蛋白却降低了酪蛋白胶束的水化。β-乳球蛋白和κ-酪蛋白形成的复合物可以在pH6.5～6.7的范围内稳定胶束，这可能是通过增加胶束的电荷或水化程度或防止κ-酪蛋白的解离来实现的。

实验结果表明90℃的加热处理导致了一些结构上的变化，在pH＜6.9时使β-乳球蛋白和κ-酪蛋白发生聚集。Sawyer提议β-乳球蛋白和κ-酪蛋白之间的反应有巯基-二硫键相互反应参与，但没有共价键（如疏水相互作用）参与。β-乳球蛋白在低温下以二聚体形式存在，30℃时解离为单体；55℃时开始展开，增加了—SH基团的活性。当pH＞6.8时β-乳球蛋白的—SH基团活性也显著增加，这主要是因为N、R构象的转换，所以β-乳球蛋白和κ-酪蛋白间通过二硫键结合的复合物的形成在高pH值下被加强了。图2-16表明了在pH6.7和pH7.3时酪蛋白胶束和β-乳球蛋白间的巯基-二硫键的反应。

通过12%TCA不溶物的NANA（N-乙酰神经氨酸）分析表明β-乳球蛋白和酪蛋白的反应防止了酪蛋白胶束的解离，见图2-17。但在较高pH值下它促进了酪蛋白从胶束中解离。这表明这种复合物在加热情况下形成，在高pH值（pH≥6.9）时从胶束中解离，并增加了pH≥6.9时胶束态的酪蛋白解离。

β-乳球蛋白在pH6.5～6.7时对酪蛋白胶束的稳定作用还不甚清楚，以下是一些机制的推测：①β-乳球蛋白和酪蛋白的聚合可以增加胶束的电荷和水化程度，使体系稳定，图2-18的结果显示β-乳球蛋白的电荷是一种重要的稳定性因素；②β-乳球蛋白结合了Ca^2＋可能降低了血清中Ca^2＋的浓度而减少了热致的磷酸钙沉淀，Singh和Fox（1987）的研究并不支持此观点；③防止了κ-酪蛋白从胶束中解离，见图2-19，这是β-乳球蛋白在pH6.7时稳定作用的主要影响因素，β-乳球蛋白通过增加净负电荷而增加了酪蛋白的稳定性。

β-乳球蛋白-κ-酪蛋白复合物对酪蛋白胶束的稳定作用依赖于温度、pH值、Ca^2＋浓度。但在一定的pH值范围内，这种复合物使酪蛋白胶束不稳定，因为当pH≥6.9时，它促进了胶束的酪蛋白的释放，因此降低了胶束的电荷、水化程度和稳定性。

（四）氨基酸组成对蛋白质热稳定性的影响

蛋白质侧链氨基酸很大程度影响蛋白质的稳定性。17种嗜热蛋白质含有芳香物质形成的串，而嗜温蛋白质则不含这些物质。芳香族物质尺寸很小，而且大量集中在嗜热蛋白质表面，靠近嗜热酶的功能位点，形成的区域结构更加坚硬。额外添加到嗜温蛋白质的芳香族物质更容易变异成为Leu、Ser或Ile。

对12个热敏感蛋白质和32个热稳定蛋白质研究表明，二肽组成影响蛋白质的热稳定性。嗜热和嗜温蛋白质表面具有相似的疏水性、紧密性、聚合性、极性和非极性，主链和侧链的氢键也相同。大多数嗜热蛋白质结合金属较多，也有更多的侧链相连的氢键，在氨基酸组成方面具有更多比例的Arg和Tyr，而Cys和Ser较少。嗜热蛋白质的α螺旋组分比例较高，而且其含的Pro较嗜温蛋白质的低很多。

N-ε-甲基赖氨酸是谷氨酸脱氢酶热稳定性的物质基础。Bacillus macerans和Bacillus amyloliquefaciens的（1，3-1，4）-β-葡聚糖酶的从Pro6到氨基酸16（或17）的N-末端环区域对它的特性有重要影响，并能影响Ca^2＋对蛋白质热稳定性的作用。

（五）自由能对蛋白质热稳定性的影响

耐高温的蛋白质具有更大的最大稳定性自由能，自由能每增加0.008kJ/mol蛋白质的耐温度能力提高1℃。用二硫键强化盐烷烃脱卤化酶（Haloalkane dehalogenase，DhlA）可变区域产生的变异体可以提高蛋白质的稳定性，DhlA包含两个区域：α/β-水解酶主要折叠区域和由5个α螺旋组成的cap区域。变异体的二硫键连接了可变区域的201位和主区域的16位，变性温度由DhlA的47.5℃升高到52.5℃，而自由活化能降低0.43kcal/mol（1cal=4.18J，下同）。

（六）结构刚性和弹性对蛋白质热稳定性的影响

蛋白质热稳定性提高会引起牛乳多肽链的弹性下降，蛋白质发挥功能时需要足够的弹性和刚性，但最适温度越高、稳定性越高，结构刚性越强。葡糖淀粉酶单一Cys变异体N20C，A27C，T72C和A471C；双Cys变异体N20C/A27C和T72C/A471C，50℃下N20C和A27C活性降低，而N20C/A27C和T72C/A471C与原来的酶活性相似。N20C/A27C热稳定性提高，65℃时自由活化能增加1.5kJ/mol，而A27C的耐热性质有轻微增加，N20C下降。pH4.5时T72C/A471C热稳定性不变。20位和27位之间的二硫键连接了C-末端的螺旋结构，该区域对该酶耐热性非常重要。

二、乳pH值的影响

（一）pH值对热稳定性的影响

pH值是影响牛奶热稳定性的最重要的单一影响因素。所有大批量的牛奶和大部分单一个体牛奶都在pH6.7有最大热凝固时间，在pH6.9有最短热凝固时间。曲线形状受很多因素影响，其中比较重要的包括：乳清蛋白、其他热变性蛋白、κ-酪蛋白、胶态磷酸钙、可溶性钙和磷酸盐、清洁剂、分析条件（温度和搅拌作用）、尿素、预热处理、乙醛、浓缩或稀释。140℃时大批量牛奶在最大热稳定性pH值下热凝固时间通常为20～30min。在如此高温下在这段相对较长的时间内，发生了一些热致变化。尽管这些变化最终导致了凝固，但相关研究很少。

Fox（1964）认为牛奶在凝固时pH值降至5.5～6.0，这种热凝固温度和pH值变化间的关系说明热致凝固是一种酸性凝固。pH值降低过程中发生的三个主要反应包括：产生有机酸，主要是从乳糖中产生的甲酸；伴随三价磷酸根释放出H^＋，一价、二价磷酸钙预沉淀；有机磷酸盐（酪蛋白磷酸盐）水解，释放出H^＋导致磷酸钙沉淀。

这些反应分别对pH值下降有50%、20%和30%的贡献。普通牛奶中pH值下降的幅度是无乳糖牛奶的两倍，其Q₁₀约为2，可溶性盐浓度不能显著影响Q₁₀，但顶空气体组成会有显著影响（乳糖分解为酸需要氧气）。

Zeta电位和水合作用都随着pH值降低而降低了。乳清蛋白和可溶性磷酸钙改变了HCT和HCT-pH曲线的形状。在常规的加热牛奶中κ-酪蛋白的水解和去磷酸化及酪蛋白的水解都起着重要的作用。但当pH值保持接近起始pH值，则其显著性可以忽略。

牛乳的pH值的微小变化都会显著影响生鲜牛乳的热稳定性。Dyson Rose曾比较不同牛所产牛乳的pH值对热稳定性的影响，结果如图2-20所示。结果表明，不同牛所产牛乳的热稳定性受pH值影响不同，但在pH6.6～6.7时都表现出最大的热稳定性，在pH6.7～6.9表现出最小的热稳定性。进一步增加pH值可以使热稳定性达到一个很高值。这种pH值高敏感性的牛奶在哺乳期内都存在，并且在其他牛奶样品中也有同样情况。从大批量的牛奶中采集的样品与2号样品的结果相似。1号样品在整个哺乳期内曲线形状很一致，但达到最大值的点不同。

从pH6.4～7.0的过程中，牛奶的热稳定性经历一个最大值和一个最小值。Rose（1962）发现当加入一些磷酸盐时，最大值的位置微微向酸性方向偏移；若加入一些钙，则微微向碱性方向偏移。但是这些离子的少量加入（约3mmol/L），只轻微地影响了可达到的最大热稳定性。

浓缩乳在pH6.4～6.6有最大热稳定性，pH＞6.8时稳定性差，总的来说浓缩乳的稳定性要明显差于原料乳。

Fox（1964）在一个试图测定被加热的牛奶样品在加热一段时间后的确切pH值的实验中，将样品在140℃加热0～20min，然后冷却到90℃保温10min，记录pH值。这个过程以10℃的间隔降至20℃，在每个温度下保温10min。牛奶的pH值在60～90℃时与温度保持近似的线性，见图2-21，但进一步冷却只导致pH值很微小的额外增加。这条曲线外推至140℃表明在140℃的凝固点（约20min）时pH值约为4.9。

在这些曲线上有两个点可以由现有的数据证实，它们吻合得很好：在0℃保温样品的曲线外推至140℃时pH值为5.7；样品在20℃凝固点测定的pH值为5.8。

考虑到在140℃下可以很快达到低pH值，则140℃时的热凝固时间相对较长。Fox（1964）将原料奶的pH值预调至5.1～5.9，然后缓慢加热，则凝固在相对较低的温度下就可以发生。将凝固点pH值对凝结温度作图，如图2-22所示。一个样品预调至pH5.5（这个pH值通过磷酸钙沉淀实现），在66℃左右发生凝固。对样品的热稳定性测试可知，当样品通过沉淀磷酸钙快速达到上述pH值，在140℃可以稳定20min，其中有一系列不稳定的变化发生。

Singh和Fox（1985）把pH6.6、pH6.8、pH7.0、pH7.2的牛奶在140℃预热1min后发现HCT/pH曲线向酸性方向漂移，但没有显著影响最大稳定性。当pH＜6.9时加热牛奶，乳清蛋白（包括β-乳球蛋白和α-乳白蛋白）和酪蛋白胶束发生共沉淀，乳清蛋白覆盖在胶束表面分散于牛奶的超滤液中，在HCT-pH曲线上表现出最大值。在较高pH值下（pH＞6.9）加热时导致乳清蛋白和富含κ-酪蛋白的蛋白从胶束中解离，残余胶束变得不稳定，在HCT-pH曲线上没有最大值和最小值。在牛奶预热过程中（140℃，1min，pH6.7）形成的乳清蛋白-酪蛋白胶束复合物在再次加热过程中（140℃，1min，pH＞6.9）从胶束中解离。胶束态的酪蛋白的解离（有时可能与乳清蛋白复合）也许有效降低了pH6.9时胶束的Zeta电位，导致了HCT-pH曲线上的最小值。

如果pH6.4～7.2的牛奶间断加热5min或10min后，重新将pH值调回到起始pH值，则不发生凝固，甚至总加热时间达4h也不发生凝结。但是，当pH6.4～7.2的去乳糖牛奶以同样的方式进行热处理，则pH＜6.9的稳定性翻倍，而pH≥6.9时下降，见图2-23。pH6.6的去乳糖牛奶加热一段时间（如1min），然后用水或盐缓冲液稀释过夜产生沉淀。

周期性地将加热过的牛奶调整到起始pH值增加了磷酸钙的沉淀，防止了钙的再溶解（通过酸化效应或乳糖分解效应），增加了可以降低酪蛋白钙敏感性还原产物的形成，抑制了赖氨酰丙氨酸的形成。因此在一定程度上防止了凝固，如将间断性加热5min或10min后的去乳糖牛奶的pH值周期性调整至起始pH值，增加了磷酸钙沉淀，但与通常的牛奶不同，由于美拉德反应对赖氨酰丙氨酸形成的抑制作用，去乳糖牛奶中酪蛋白的钙敏感性可能增加。pH＜6.9的去乳糖牛奶的HCT翻倍，可能是由于磷酸钙的沉淀（周期性中和的结果）而导致Ca^2＋损耗的增加；而pH≥6.9时HCT增加，可能是由于形成赖氨酰丙氨酸而导致酪蛋白的钙敏感性增加。钙敏感性增加可能也与去乳糖或去乳糖/去尿素的牛奶在140℃仅加热1min就产生沉淀有关。

（二）pH值变化的可逆性

Rose和Tessier的数据显示在110℃超滤获得的牛奶浆液的pH值约为5.9。由他们的数据外推至140℃可知，140℃时pH值大约为5.5，并且可能对外推曲线的曲率的依赖性较小。磷酸钙的pH值漂移平衡很快就能实现（平衡在5min内就可以达到）。这就是说，140℃下牛奶的pH值在5min内可以从6.7降至5.5。

热致产生的pH值变化是可逆的，但在冷却时重新建立平衡是很缓慢的，特别是在剧烈的热处理后。Sweetsur和White将牛乳样品冷却至20℃后10min时立即测定pH值，此时平衡还未达到，这时的pH值部分是由于乳糖产生的酸得到的，部分是由磷酸钙沉淀产生的，但其影响程度尚不能确定。

pH≤6.9温度高于90℃时加热牛奶10min，乳清蛋白与酪蛋白复合并发生共沉淀，而当较高的pH值下（pH7.3）加热时，含有乳清蛋白和高酪蛋白含量的蛋白从胶束中解离。缺乏酪蛋白的胶束比有乳清蛋白覆盖的胶束或天然胶束对热、Ca^2＋、乙醇更为敏感，可以很快地被凝乳酶所凝固。在预热前将分离的κ-酪蛋白加入脱脂奶中，它并没有和胶束聚合（pH＞6.9）。十二烷基磺酸钠增加了非沉淀氮（NSN）和N-乙酰神经氨酸（NANA）的水平，并使NSN-pH曲线和NANA-pH曲线向酸性方向漂移；而十六烷基三甲基铵溴化物则有相反的效果。这说明这种依赖于pH值的κ-酪蛋白胶束的解离是可逆的，依赖于胶束表面的电荷；在一定的负电荷下，疏水键和静电键断裂，导致κ-酪蛋白从胶束中解离。

（三）加热过程中pH值变化导致的热稳定性变化

一些实验证明加热时pH值的降低是导致牛奶在加热过程中凝结的最重要的影响因素。尿素对牛奶的稳定性作用可以推断为热分解后的pH缓冲能力。Fox（1964）将一个pH6.70的样品在140℃加热10min后pH值降至6.14。将样品pH值重新调至6.70，在140℃重新加热10min，pH值又降至6.21。将pH值又重新调回6.70。这个加热-重新调整pH值的循环总共进行了八次，从每一个样品中取出1.5mL在140℃加热至凝结。从每个样品中取出10mL于30mL试管中在140℃加热，加热时间依据各自的热凝结时间，然后冷却至20℃，测定pH值，结果如表2-7所示，与Pyne的结果一致，如果牛奶的pH值偶尔调至其起始pH值，它的热稳定性或多或少是无穷的。

三、乳中矿物质对热稳定性的影响

随着温度增加、pH值升高，磷酸钙的溶解性下降；在120℃、pH6.8时，磷酸钙溶解性有一显著下降，这与HCT-pH曲线上最低点一致。

加热时磷酸钙沉淀可能以一种羟（基）磷灰石Ca₁₀（PO₄）₆（OH）₂的形式存在。这与固有的酪蛋白磷酸钙（CCP）不同，CCP含有3个磷酸钙·柠檬酸氢钙和2.5个磷酸钙·磷酸氢钙·0.5柠檬酸钙。柠檬酸盐在加热时不会沉淀，这也许是由于组成不同造成的。热沉淀的磷酸钙在冷却时甚至pH4.7时可溶性较差，低于固有的CCP，特别是温度大于110℃时可溶性更差。当加热的牛奶冷却时由于钙和磷酸根的原因变得不饱和了，部分原有的CCP溶解而恢复了平衡。

牛奶中热沉淀的磷酸钙可以通过酪蛋白胶束结合而防止沉淀。酪蛋白胶束结合的机制尚不清楚，可能是通过羧基，降低胶束的Zeta电位和水合能力。热沉淀的磷酸钙可能会覆盖在酪蛋白胶束的表面。

在加热过程中发生的一些变化实际上增加了热稳定性。这些变化从图2-23中看是显然的，图2-24是牛奶样品在140℃加热0～20min时pH值对凝结温度的曲线。被加热样品稳定性提高的一个可能的原因是降低了加热过程中Ca^2＋浓度，但这还未能用实验来证明。Pyne认为在加热过程中酪蛋白对Ca^2＋的敏感性降低，但这个变化的本质尚不清楚。

四、乳中胶态磷酸盐对乳热稳定性的影响

很早以前我们就知道，乳中的胶束有两个主要成分——磷酸钙盐和酪蛋白酸钙。1915年，Van Slyke发表了一篇文章开始讨论磷酸钙以及它们和酪蛋白之间的键。其中包括两个问题：①磷酸钙是二价或三价钙盐还是二价与其他形式的混合物?②磷酸钙是完全或部分以化学键与酪蛋白相连，还是只是一种吸收现象?

由于缺乏关于有多少钙与酪蛋白直接相连的知识，所以我们试图采用分析各种牛奶组分的方法测定胶态磷酸钙的组成总是失败。酪蛋白含有大量酯化磷酸基团，尽管它们都表现为单一酯化磷酸盐，但不可能计算与钙发生反应的磷酸盐中的游离酸基的范围。酪蛋白也含有能与钙反应的羧基。能与酪蛋白相连的钙的数量是相当大的，所以在估计上的一个小小失误都会使无机磷酸钙的计算无效。

发展了许多滴定方法来估计牛奶中的磷酸钙的组成。Pyne和MeGann使用一种稀释渗析的方法不明显改变酪蛋白中钙的含量就可以去除无机磷酸钙。由此得出结论，无机磷酸钙实际是一种磷灰石类的磷酸钙-柠檬酸钙的复合物。新沉淀的磷酸钙存在两种形式：①可能是一种凝胶态的八聚磷酸钙，钙磷比（以物质的量计）为1.33∶1，它有很高的活动性可以将H^＋交换为CaOH^-，当钙磷比接近1.66∶1时形成沉淀；②一种粒状形式很可能是有核的磷酸二钙，但它很快就转变成碱性盐，钙磷比为（1.2～1.6）∶1。与磷酸钙相关的任何盐类不可能是从液相中的钙和磷而来，二聚磷酸钙（Ca₂HPO₄）只在很小的离子浓度和pH值范围内在液相中稳定。

柠檬酸盐趋向于延缓二聚磷酸盐和其他粒状盐在稳定的钙离子浓度下的沉淀，但不显著影响沉淀形成的类型。根据Boulet的数据，柠檬酸盐可以不同程度地与粒状盐结合，这主要取决于转化的条件。在这方面柠檬酸盐与碳酸盐相似。牛奶中的分散相和液相都是复合的、可变的，并且都与导致或伴随凝固的反应相关。即使在同一牛奶中，沉淀相的粒子也不是唯一的。通过直接分馏和分析技术已经证实离子的大小和组成是变化的，同一种牛奶中粗糙微小的离子的行为也证实了表面组分的不同。由于这种复杂性，尚可能在近几年中被彻底解释。但是我们可能可以很好地定义这些组分的化学和生物化学性质。进一步的研究将集中于形成和影响天然胶束的性质的小组分和它们之间的相互反应。

Hart（1919）把乳的热稳定性差异主要归因于乳中盐含量的不同，按其理论最稳定的乳中，Ca、Mg之和对磷酸盐、柠檬酸盐之和应有合理的值，偏离此值乳的稳定性下降，低稳定性乳常归因于过量Ca、Mg的存在。Rogers（1921）、Holm（1923）认为乳中盐浓度和热稳定性间没有直接关系，pH值和乳盐平衡使乳有最好的热稳定性，加工者应用钙盐改善恶劣浓缩乳的稳定性。溶解盐类尤其是钙和磷酸盐在原料乳和浓缩乳的热稳定性方面有重要作用。钙盐增加，热稳定性下降（此时Ca^2＋浓度增加，CCP增加，pH值下降），若增加柠檬酸盐和磷酸盐以减少Ca^2＋的浓度，此时CCP减少，乳稳定性增加。

Morrissey（1969）研究表明，若可溶性钙和镁在正常乳中由13mmol/L减至11mmol/L，最不稳定性的区域稳定性增加，最大稳定性的区域稳定性减少，此时A型乳转化为B型乳。反之增加Ca^2＋浓度降低了最小稳定性区域的稳定性。Sweetsur和White（1974）证实，增加乳盐浓度在pH6.7以下可增加稳定性，在pH＞7.3处形成第二个稳定性最小的区域，A型乳转化成B型乳，最大稳定性区域的稳定性减小，最小稳定性区域的稳定性增加。水的稀释（40mL水/100mL乳）增加最小稳定性区域的稳定性，对最大稳定性区域没有影响。

胶体磷酸钙（CCP）在乳的酪蛋白结构中起着重要作用，Pyne等人应用酸化或渗析技术去除胶体磷酸钙后明显增加了乳的热稳定性，Fox等人研究表明，去除40%的CCP在最差稳定性区域可增加稳定性，若CCP去除60%以上pH＞7.1，乳的热稳定性下降，CCP增加一倍在整个pH值范围内使乳热稳定性稍有下降。

将牛奶中的胶态磷酸钙含量减少40%或增加20%不会显著影响κ-酪蛋白胶束与pH值相关的热致解离。但可溶性钙和磷酸盐的改变显著影响了κ-酪蛋白的解离。降低磷酸盐的浓度或增加钙的浓度减少了非沉淀氮（NSN）和非沉淀N-乙酰神经氨酸（NANA）的形成。将牛奶对水进行短时间透析（约5h），减少了非沉淀氮（NSN）和非沉淀N-乙酰神经氨酸（NANA）的形成，此时NaCl浓度大于0.05mol/L。用琥珀一酰化改性蛋白质的氨基促进了κ-酪蛋白的释放，而羧基的酰氨化则具有相反的效果。这表明加热的牛奶在90℃以上加热时产生的与pH值相关的κ-酪蛋白的解离是由静电反应所控制的。如Ca^2＋、Na^＋等可溶性离子的作用表现为磷酸丝氨酸基团、羧酸基等蛋白质上的负电荷基团的保护作用，这样减少了κ-酪蛋白的释放。

镁存在于牛奶中，研究已经证实镁促进了更多的可溶性磷酸钙（凝胶状的）的分散，同时伴随少量粒状盐的沉淀。镁还延迟了二聚磷酸钙向碱性形式的转化，但并没有进入这些盐类的结构。

五、泌乳期对热稳定性的影响

一般原料乳热稳定性的不同，一定是由于组成上的差异引起的，通常有较大的季节性影响。乳牛个体之间的差异也相当大。

Dyson Rose（1961）曾对处于不同哺乳期的个体奶牛所产牛乳的组成和热稳定性进行研究。结果发现，在哺乳期的早期和晚期时，牛乳中大部分成分的浓度都高于哺乳中期，其易变性的乳清蛋白含量过高（如图2-25所示）。例外的是β-酪蛋白，它在哺乳早期处于正常范围，但哺乳晚期趋于下降。此外，初乳和末乳的pH值也不在乳的最稳定pH值范围内。季节对热稳定性的影响已有广泛的报道，它主要受饲料、气候等影响。可溶性非有机磷在哺乳晚期含量也较低；而总柠檬酸盐、可溶性柠檬酸盐和可溶性钙在整个哺乳期中有明显的下降。

Andrew等（1999）发现，哺乳早期和哺乳中期牛奶中总乳清蛋白的变性速率基本相似，但哺乳晚期则相对较高。哺乳晚期的牛奶中单一乳清蛋白的变性速率也比较高，这可能是由于总乳清蛋白浓度较高。哺乳晚期的牛奶中含有较多的易变性的免疫球蛋白、血清白蛋白/乳铁蛋白组分。

六、温度对热稳定性的影响

Rose（1962）的研究表明，预热对乳热稳定性的影响是使热稳定性-pH曲线向酸性区域稍有移动，即在预热过程中热稳定性变化是pH值下降的函数，若预热前乳的pH值增加，最大稳定性的pH值进一步移向更酸的区域。120℃、20min或150℃、1.5min的预热在热稳定性最小的区域增加了乳的热稳定性，将A型乳转向为B型乳。100℃、5min的预热乳增加了最终产品浓缩乳的热稳定性，这在商业上已用于蒸发乳和热稳定性乳的加工。商业上常采用下列预热温度和时间：80～90℃、30min（澳大利亚）；95℃、10min（爱尔兰）；105～120℃、30～180s（新西兰）。长期以来已经认识到预热牛奶比浓缩更有利于稳定性。Rose采用的最强烈的预热处理是120℃、10min。对牛奶进行更剧烈的预热处理对热凝固时间（HCT）-pH值曲线有一个有趣的影响（如图2-26所示）。在pH6.3～7.1的范围内，在120℃预热10min导致稳定性下降，但进一步加热时在最小值范围内稳定性增加，140℃预热20min可以获得一条B型曲线，在整个pH值范围内进一步加热导致稳定性增加。Davies也报道高预热温度使稳定性增加。

Roger（1999）等对预热温度对未经浓缩的牛奶的热稳定性影响进行了研究。

（一）冷却对预热过的牛奶的热稳定性的影响

当pH6.4～7.2的牛奶在90℃预热1h（图2-27）后，70℃预热15h后，然后冷却到20℃（图2-28），则它们在140℃的热稳定性基本与未经预热的牛奶保持一致。但是若在100℃预热1h，则140℃的稳定性降低，特别是在140℃测定前冷却到20℃（图2-27）。当牛奶在100℃预热1h（pH6.4～7.2）后不经冷却而直接以设定的速度从100℃升温至140℃（图2-29），则热凝固时间和温度与未经预热的牛奶相似。但同样预热的牛奶先冷却到20℃，然后再浸没在100℃油浴中，油浴的温度按设定的速度升至140℃，则牛奶的热稳定性显著下降，见表2-8。这些结果表明当温度＜100℃时的一些热致变化，如乳清蛋白的变性和胶束态酪蛋白的降解可能损害了牛奶在140℃时的稳定性；只有当预热的牛奶经过冷却时，升温过程中发生的反应可能短时间地增加牛奶蛋白之间的疏水相互作用，当再次加热温度达到70℃时，达到最大值。

HCT_t指的是脱脂牛奶自20℃或100℃加热至凝固温度（即HCT_p）所需时间。加热速率为3.75℃/min（自20℃至65℃），2.75℃/min（自65℃至90℃），1.75℃/min（自90℃至120℃）和1.12℃/min（自120℃至140℃），见图2-27。

（二）140℃预热的影响

当pH6.4～7.2的牛奶在140℃加热，以5min的时间间隔冷却到20℃，整个的加热时间比未预热的牛奶HCT长30%～40%（图2-30）。间断加热牛奶的凝固点pH值比连续加热牛奶的凝固点pH值低0.1，表明前者酪蛋白的热稳定性略优于后者。

图2-31的结果表明同样的牛奶在HCT-最大或HCT-最小的pH值下140℃加热2min、4min、6min、8min或10min后，4℃过夜，然后将pH值调整到起始pH值，HCT-最大pH先降低，而当预热时间延长至4min时有上升，而HCT-最小pH则在整个过程中持续下降。

图2-32是在牛奶加热时加入0～7mmol/L的乙二醛（乳糖的一种热降解还原产物），当浓度为1mmol/L时HCT-最大pH降到最小值，但浓度高于2mmol/L时则上升。与预热的效果相似，乙二醛浓度增加时HCT-最小pH也增加。由于牛奶中还原产物在140℃加热的早期阶段形成，乙二醛浓度增加产生的影响与140℃预热产生的影响类似，这可能是美拉德反应对牛奶在140℃的稳定性有很大的影响，这也解释了为何关于在UHT温度预热牛奶对热稳定性影响的报告不能总达成一致。

似乎有效的还原产物只在HCT-最大pH值下140℃加热超过4min时形成，用N2代替空气对HCT-最小pH也或多或少有稳定作用。预热的效果随自身尿素浓度的变化而变化，它对美拉德反应和浓缩的或未浓缩的牛奶的热稳定性有明显的作用。Kelly报道，尿素通常不增加浓缩牛奶的热稳定性，在预热或喷雾干燥前加入则增加了热稳定性。

七、乳糖对热稳定性的影响

乳糖会降低乳的热稳定性，若添加65g/L乳糖于乳中，在整个pH值范围内降低了乳的热稳定性。

与通常的牛奶不同，由于美拉德反应对赖氨酰丙氨酸形成的抑制作用，去乳糖牛奶中酪蛋白的钙敏感性可能增加。pH＜6.9的去乳糖牛奶的HCT翻倍，可能是由于磷酸钙的沉淀（周期性中和的结果）而导致Ca^2＋损耗的增加，而pH≥6.9时HCT增加，可能是由于形成赖氨酰丙氨酸而导致酪蛋白的钙敏感性增加。钙敏感性增加可能也与去乳糖或去乳糖/去尿素的牛奶在140℃仅加热1min就产生沉淀有关。

Tan-Kintia和Fox（1999）发现未间隔加热的去乳糖牛奶的HCT-pH曲线在pH7.1～7.2有一个第二HCT-最大pH值，如图2-23所示。此时凝固很少，凝固物很松散。这也许是由于当pH＞7.4不间断地加热去乳糖牛奶时，钙敏感性的增加快于Ca^2＋的降低。除了由于中和时加入碱而导致的曲线的漂移，pH6.3～7.3间断性加热和中和去乳糖牛奶得到的HCT-pH曲线可能与不间断的加热pH7.0～7.4的去乳糖牛奶的HCTpH曲线相似。

与不间断加热去乳糖牛奶不同，在pH≥7.4间断加热去乳糖牛奶的稳定性较高（见图2-24），这可能是由于在加热过程中磷酸钙沉淀增加，弥补了由于酪蛋白的钙敏感性增加而导致的不稳定效果。