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第四节 分子生物学诊断
急性呼吸道感染是世界范围的常见病、多发病，其主要原因是由流感和其他各种呼吸道病毒引起，其临床表现相似，如鼻炎、流涕、鼻塞、咳嗽、轻度咽炎、全身发热等症状。由于可能的病原种类很多，而病毒的分离培养不仅周期长，技术上也比较困难，用免疫学检测方法也很难快速确定病原体，因此其病原检测一直存在困难。近十几年来，分子生物学方法，特别是基于聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术的检测方法在病毒检测领域得到迅猛发展，成为病毒检测的一项革命性技术。PCR技术检测方法不仅速度快，灵敏度高，还可以同时检测数种病原体。
虽然分子生物学辅助诊断方法在临床实践中遇到一些问题，如PCR的假阳性与假阴性问题，但基因诊断具有一些特殊优点，如需样量少、快速灵敏和准确、应用范围广泛等。
一、聚合酶链式反应
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外DNA扩增技术，可以在短时间内获得所需的大量的特定基因片段。PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg＝10 -12g）量级的起始待测模板扩增到微克（μg＝10 -6g）水平。能从100万个细胞中检出1个靶细胞。在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个rfu（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个cfu（集落形成单位）。
目前临床上可运用于检测结核分枝杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒等病原微生物的核酸检测，诊断这些呼吸道病原体的感染存在。
二、其他方法的DNA扩增
（一）分支DNA测定技术
分支DNA测定技术基于其独特的信号放大系统，即分支DNA信号放大系统，这是一个人工合成的分支DNA，分支DNA的分支可结合多个酶标记物，将病毒或细菌的信号放大，从而提高了灵敏度，以便进行检测。此检测系统不涉及核酸扩增反应。最少每孔有60个拷贝就可以得到阳性结果，比起real-time PCR重复性好，因为前期的人为操作少。
（二）链置换扩增术
链置换扩增术是近几年发展起来的一种酶促DNA体外等温扩增方法。与其他的DNA扩增技术相比，链置换扩增术有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。在临床上检测痰标本中的结核分枝杆菌方面，链置换扩增术是一种很有用的方法。
（三）环介导等温扩增
自从Notomi等研究者于2000年公布该技术以来，该技术已经被广泛地应用于生命科学领域，其中就包括对病原体感染的检测。环介导等温扩增在越来越多的领域中被使用，包括病毒病原体的检测、细菌病原体的检测、真菌病原体的检测。
三、RNA扩增
（一）转录介导的核酸扩增
转录介导的扩增技术可以RNA或DNA为模板，利用RNA聚合酶和逆转录酶在约42℃等温反应条件下进行扩增，产物为RNA。转录介导的核酸扩增已成功用于沙眼衣原体、淋病双球菌和肺结核分枝杆菌的检测，且检测沙眼衣原体与结核分枝杆菌的试剂盒已得到美国FDA批准上市。
（二）核酸序列依赖的扩增
该方法是由一对引物介导的连续均一的体外特异的对单链RNA进行恒温扩增的过程，在42℃条件下2小时左右可将模板RNA扩增约10～12倍。核酸序列依赖的扩增可用于检测呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、鼻病毒-15、A/B两型流感病毒等，敏感性高，特异性好。
四、基因芯片
基因芯片技术最大的特色在于其高通量检测，这是目前所有病毒检测技术都未曾解决的。利用基因芯片技术，完全有可能通过一次检测获得所有病毒信息，甚至包括以前未曾发现的新病毒或新变异株。临床上基因芯片技术已经用于结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌检测、呼吸道病毒联合检测等，具有简便、快捷、灵敏、特异等优势。
（沈立松 刘宏景 陈 惠）
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