实验七 免疫细胞形态学观察
免疫细胞包括淋巴细胞（T细胞、B细胞等）、单核-巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞、肥大细胞等，其中T细胞和B细胞被称为免疫活性细胞。本次实验重点介绍吞噬细胞的吞噬现象观察、E花环形成试验、淋巴细胞转化试验。
实验目的
熟悉 吞噬细胞的吞噬现象观察的方法及意义，E花环形成试验的操作步骤及临床意义，淋巴细胞转化试验的操作步骤及临床意义。
实验内容
（1）吞噬细胞的吞噬现象观察。
（2）E花环形成试验。
（3）淋巴细胞转化试验。
一、吞噬细胞的吞噬现象观察
基本原理
体内具有吞噬功能的细胞群按其形态的大小分为两类：一类为大吞噬细胞，即组织中的巨噬细胞和血液中的单核细胞。它们对异物有吞噬和消化的功能，在机体非特异性免疫、特异性免疫和免疫调节中具有重要的作用，因此，通过测定吞噬细胞的吞噬作用可判断机体的免疫力。另一类为小吞噬细胞，即血液中的中性粒细胞。中性粒细胞的功能包括黏附、移动、吞噬、杀菌等，是机体天然免疫力的重要组成部分。
实验材料
（1）中性粒细胞吞噬葡萄球菌标本片。
（2）巨噬细胞吞噬鸡红细胞标本片。
（3）香柏油、显微镜、擦镜纸、二甲苯等。
实验方法
1.中性粒细胞吞噬葡萄球菌镜下观察 油镜下寻找中性粒细胞，观察细胞质中有无吞噬的葡萄球菌。镜下可见染成紫色的细胞核及被吞噬的葡萄球菌，细胞质则为淡红色。
2.巨噬细胞吞噬鸡红细胞镜下观察 在油镜下，鸡红细胞为淡红色、椭圆形、有核的细胞。而体积较大圆形或不规则的细胞，其表面有许多似毛刺状的小突起（伪足），细胞质中有数量不等的蓝色颗粒（为吞入的含台盼蓝淀粉形成的吞噬泡）即为巨噬细胞。可见有的鸡红细胞（一至多个）紧贴附于巨噬细胞的表面，有的巨噬细胞已将一至数个鸡红细胞部分吞入；有的巨噬细胞已吞入一个或数个鸡红细胞在胞质中刚刚形成椭圆形的吞噬泡。
实验结果
1.中性粒细胞吞噬百分率 即100个中性粒细胞中吞噬有细菌的细胞数。中性粒细胞吞噬指数=100个中性粒细胞中所吞噬的细菌总数/100。
2.巨噬细胞吞噬百分率 即100个巨噬细胞中吞噬有鸡红细胞的细胞数，吞噬百分率正常值为60%左右。巨噬细胞吞噬指数=100个巨噬细胞中所吞噬的鸡红细胞总数/100。
注意事项
镜下鸡红细胞呈橄榄球形，有清楚的细胞核，染色后清晰可见，注意与小白鼠的红细胞相区别。
临床意义
（1）吞噬百分率及吞噬指数对于临床诊断一些恶性肿瘤及免疫缺陷病有一定价值。
（2）吞噬百分率及吞噬指数可作为肿瘤放疗、化疗、免疫治疗疗效观察的参考指标。
（3）吞噬指数的动态观测对于判断肿瘤复发或转移有一定价值。
二、E花环形成试验
基本原理
T细胞表面有能够与绵羊红细胞（SRBC）表面糖肽结合的受体，称为E受体（CD2）。CD2是一种糖蛋白，目前已证实E受体是人类T细胞主要的表面标志之一。当T细胞与SRBC混合后，SRBC便黏附于T细胞表面，呈现花环状。通过花环形成检查T细胞的方法，称为E花环形成试验。根据花环形成的数量，可测算T细胞的数目。
实验材料
（1）瑞氏染色液。
（2）聚蔗糖-泛影葡胺（分层液）。
（3）Hank's液（pH 7.2～7.4）。
（4）0.8%戊二醛溶液（用Hank's液将戊二醛配成0.8%，然后用1mol/L NaOH将pH调至7.2～7.4）。
（5）肝素抗凝血2ml。
（6）小牛血清（经56℃30分钟灭活后，灭活血清与SRBC按2∶1的比例混合，置37℃30分钟，离心，吸上清液备用）。
（7）1%SRBC悬液（脱纤维的绵羊静脉血100ml加Alsever保存液50ml，置4℃冰箱保存。实验前以Hank's液洗3次，1500r/min，离心10分钟，弃上清液，将压积红细胞用Hank's液配成1%SRBC悬液，细胞浓度约为每毫升8×107个）。
实验方法
（1）采用聚蔗糖-泛影葡胺（分层液）密度梯度离心法分离淋巴细胞，计数后，用Hank's液配成每毫升8×107个细胞悬液。
（2）取细胞悬液0.1ml，加入1%SRBC悬液0.1ml及小牛血清0.05ml，混匀。
（3）37℃静置5分钟，500r/min低速离心5分钟后，放入4℃冰箱2小时或过夜。
（4）取出试管，吸取上清液，加0.8%戊二醛溶液1滴，轻轻旋转混匀，置4℃冰箱固定15分钟。
（5）取出试管后，轻轻旋转试管，使沉淀细胞重新悬浮；取1滴涂片，自然干燥后，瑞氏染色，高倍镜下观察。
实验结果
计数200个淋巴细胞，凡结合3个SRBC或以上者为E花环阳性细胞，按下列公式计算E花环形成率：
注意事项
（1）全部试验必须在室温（16～23℃）下进行。
（2）最好用新鲜的SRBC，保存于Alsever液中的SRBC 2周内可以用，超过2周SRBC与淋巴细胞的结合能力下降。
（3）从采集血液到实验测定，不许超过4小时，否则SRBC受体会自行脱落。试验中活细胞不少于95%。
（4）计数前应将沉于试管底的细胞予以重悬，但只宜轻缓旋转试管，使细胞团块松开即可，不能过猛或强力吹打，否则花环会消失或减少。
临床意义
E花环形成试验在临床上主要用于外周血T细胞数量、功能的检测。
三、淋巴细胞转化试验
基本原理
T细胞在体外培养过程中，如果受到有丝分裂原受体如植物血凝素（PHA）等刺激后，会转化为体积较大的母细胞，细胞质增多且深染，细胞核增大并可见核仁，同时部分细胞可出现有丝分裂，通过计数转化细胞的百分率可在一定程度上反映体内T细胞的免疫功能。
实验材料
（1）吉姆萨染液。
（2）固定液（甲醇与冰醋酸按9∶1混合即可）。
（3）RPMI-1640细胞培养液（完全细胞培养液）。
（4）植物血凝素（使用RPMI-1640培养液配成1000μg/ml）。
（5）NH4Cl（8.5g/L）。
（6）显微镜、离心机、二氧化碳培养箱、细胞计数器等。
（7）肝素抗凝血。
实验方法
（1）将肝素抗凝血0.1ml加入RPMI-1640细胞培养液1.8ml中，同时加入植物血凝素0.1ml，对照管不加植物血凝素，将细胞置于5%CO2、37℃培养箱中培养3天，每天振摇1次。
（2）培养结束时弃去大部分上清液，加入NH4Cl（8.5g/L）4ml混匀，置于37℃水浴10分钟。
（3）2500r/min离心10分钟后弃上清液，沉淀后加固定液5ml、温室固定10分钟。
（4）2500r/min离心10分钟后弃上清液，留0.2ml沉淀细胞制片，迅速吹干。
（5）吉姆萨染液染色10～20分钟，水洗，干燥。
（6）油镜计数200个淋巴细胞中转化的细胞数，计算转化率。
实验结果
（1）淋巴母细胞的形态学标准是细胞核的大小，细胞核与细胞质的比例，细胞质染色性及细胞核的构造、核仁的有无。可以见到以下几种类型细胞。
1）成熟的小淋巴细胞：其与未经培养的小淋巴细胞大小一样，为6～8μm，细胞核染色致密，无核仁，细胞核比细胞质比例大，细胞质染色为轻度嗜碱性。
2）过渡型淋巴细胞：体积要比小淋巴细胞大，为10～20μm，细胞核染色致密并出现核仁，这是与成熟小淋巴细胞的区别要点。
3）淋巴母细胞：细胞体积明显增大，为20～30μm，细胞形态不整齐，常有小突出，细胞核变大，核染色疏松，有核仁1～2个，细胞质变宽并出现细胞质空泡。
（2）淋巴细胞转化率的计算。计数200个淋巴细胞，算出百分率：
转化的淋巴细胞包括淋巴母细胞和过渡型淋巴细胞，未转化的淋巴细胞指的是成熟的小淋巴细胞。在正常情况下，植物血凝素诱导淋巴细胞转化率为60%～80%，如为50%～60%则偏低，50%以下则为降低。
注意事项
（1）小牛血清用前需灭活。
（2）RPMI-1640细胞培养液成分对转化率影响较大（实验前调至含小牛血清10%、谷氨酰胺30g/L、链霉素100μg/ml、青霉素100U/ml，并将pH调至7.2～7.4），注意其有效期。
（3）培养时要保证有足够的气体，一般10ml培养瓶内液体总量不要超过2ml。
（4）实验过程中要严格无菌操作，防止污染。
临床意义
淋巴细胞的转化情况可反应机体的细胞免疫水平。淋巴细胞转化率降低表示细胞免疫水平低下，可见于恶性肿瘤、淋巴瘤、淋巴肉芽肿、重症真菌感染、重症结核等。此外，本试验还可帮助观察疾病的疗效和预后，经治疗后转化率由低值转变为正常者表示预后良好，反之则预后不良。