实验八　淋巴细胞功能检测

一、特异性CTL功能检测

实验目的

1.熟悉　特异性CTL功能检测的操作及原理。

2.了解　特异性CTL功能检测的临床意义。

基本原理

细胞毒性T细胞（CTL）是T细胞经靶细胞抗原在体内或体外刺激后所产生的一种效应T细胞。当再次与靶细胞抗原接触时，可表现出破坏、溶解靶细胞的特性。这种特性称为淋巴细胞参与的细胞毒性（LMC），测定LMC的方法称为LMC试验。

CTL杀伤相应的靶细胞，可通过形态学检查法和同位素标记法测定其杀伤活性，其中形态学检查法是用显微镜计数残留的靶细胞数，计算淋巴细胞对靶细胞生长的抑制率。本节主要介绍同位素标记法，以51Cr释放试验为例。铬酸钠（）中六价铬被活细胞摄取后，可与细胞质内的大分子物质（如蛋白质）结合，使靶细胞被标记。当标记51Cr细胞受到损伤或死亡后，以三价铬的形式被溶解的细胞释放出来。用51Cr标记靶细胞，将靶细胞和活化的CTL混合反应后，通过检测被CTL所杀伤的靶细胞释放到培养上清液中51Cr的放射计数率（cpm）即可判断CTL的杀伤活性。

实验材料

（1）靶细胞（K562细胞）。

（2）效应细胞（诱导产生的CTL），对照效应细胞（未致敏的脾细胞）。

（3）10%FCS-RPMI 1640培养液。

（4）有丝分裂原（1mg/ml ConA，溶于PBS）。

（5）1Mci/ml，溶于等渗缓冲液。

（6）96孔培养板、112μm孔径筛网、微量加样器、5%CO2培养箱、2%TritonX-100、51Cr计数管、小玻璃管、γ计数器等。

实验方法

（1）制备靶细胞

1）收集对数生长期的靶细胞，用10%FCS-RPMI 1640培养液调整细胞浓度为5×107/ml，取1ml室温1200r/min，离心5分钟，弃上清液。

2）轻悬细胞，加1Mci/ml 及10%FCS-RPMI 1640培养液20μl。轻轻混匀，37℃，5%CO2培养箱孵育1～2小时。

3）用10%FCS-RPMI 1640培养液将靶细胞洗2～3次，重悬靶细胞，调整细胞浓度为1×105/ml。

（2）制备效应细胞：淋巴细胞经有丝分裂原刺激培养5天获效应CTL，调整效应细胞浓度为1×106/ml。

（3）96孔培养板每孔加入CTL 100μl，设3个复孔，每孔加靶细胞100μl，1200r/min，离心30秒，以促进效应细胞与靶细胞之间的接触。37℃，5%CO2培养箱孵育3～5小时。另设只含100μl标记靶细胞的空白孔2孔，其中一孔加10%FCSRPMI 1640培养液100μl作为自然释放对照孔，一孔加2%TritonX-100 100μl作为最大自然释放对照孔。

（4）培养结束后，1200r/min，离心5分钟，收集每孔上清液100μl于小玻璃管中，用γ计数器测上清液的cpm值。

实验结果

按下式计算杀伤效应：

备注：实验孔cpm为三孔cpm的均值。

注意事项

（1）靶细胞应为对数生长期细胞，用台盼蓝染色法检测靶细胞的存活率（应＞ 95%）。标记后的自然释放率应＜15%。

（2）51Cr半衰期为28天，标记时总体积应较小（0.05～0.1ml），51Cr标记后的靶细胞应尽快加入效应细胞中。与效应细胞作用时间也不宜过长，因为随时间的延长，死细胞增多，自然释放率也随之增高。

（3）效靶细胞比率一般选择（50～100）∶1。效应细胞与靶细胞在室温下就能很好结合，但靶细胞的裂解必须在37℃。孵育时间与效应细胞的活性和靶细胞自发51Cr释放水平有关，因此应进行预实验加以确定。

（4）使用51Cr溶液或51Cr标记细胞时，应严格遵守同位素操作条例。

（5）51Cr释放法的最大问题是靶细胞在无CTL存在时的51Cr自发释放。通常在3～4小时的实验中，自发释放约为最大释放的5%～30%。自发释放必须小于最大释放的30%，实验才成为可行。减少自发释放的措施包括：①缩短实验时问。②选用敏感的靶细胞，缩短标记时间。③应保证标记细胞最后一次洗涤的游离51Cr最大释放率低于5%。④除进行细胞表面修饰（如标记TNP）外，靶细胞悬液中均应加入外源蛋白，如FCS。⑤对靶细胞的操作要轻柔。

临床意义

本实验是评价机体抗原特异性CTL活性的一个指标，特别是测定肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力，常作为判断预后和观察疗效的指标之一。也可为肿瘤的免疫治疗提供新的方法和思路。

二、B细胞抗体形成功能检测（溶血空斑试验）

实验目的

1.熟悉　B细胞抗体形成功能检测的操作及原理。

2.了解　B细胞抗体形成功能检测的临床意义。

基本原理

溶血空斑试验又称PFC测定技术，它是在体外检查和计数产生IgM或其他类型Ig的抗体生成细胞的一类试验。通常是用绵羊红细胞经腹腔免疫小鼠，3～5天后取脾脏，制成脾细胞悬液与相应数量的绵羊红细胞（指示细胞）和补体混合，注入载玻片小室内，经37℃培养箱培养后，单个散在抗体生成细胞释放抗体，抗体与周围的绵羊红细胞（抗原）结合，并在补体参与下，使绵羊红细胞溶解，结果在抗体生成细胞周围形成肉眼可见的圆形透明溶血区——溶血空斑。计算空斑数目，即可推算脾脏内存在的抗体生成细胞的总数。本试验可作为判断机体体液免疫状态的指标，研究免疫增强和抑制药物对机体免疫功能的影响等特异性指标。具有特异性高，筛检力强，可直接观察等特点。PFC测定技术目前所用的方法有：琼脂固相法、单层细胞法、小室液相法。下面介绍小室液相法。

实验材料

（1）解剖器械包括眼科剪，眼科镊，平皿，100目不锈钢网，小玻璃漏斗，100目尼龙布。

（2）试管，吸管。

（3）载玻片（双面胶条制成小室）。

（4）石蜡盘，酒精灯。

（5）微量移液器及塑料头。

（6）小鼠。

（7）5%和15%绵羊红细胞（SRBC）悬液，新鲜豚鼠血清，Hank's液（含5%新生小牛血清）。

实验方法

1.免疫小鼠及脾细胞悬液的制备　用5%SRBC悬液0.4ml（约4×108个）注射于小鼠腹腔，4天后拉脱颈椎处死，取出小鼠脾脏放在已加入5ml Hank's液的平皿中，用100目不锈钢网研磨后，经100目尼龙布过滤放入试管中，1000r/min，离心5分钟，洗2次，将沉淀的脾细胞重悬于4ml Hank's液中，细胞计数，配成1×107/ml细胞浓度的脾细胞悬液。

2.补体制备　新鲜豚鼠血清，在4℃冰箱内与绵羊红细胞混合30分钟，然后重新分离获取血清，用Hank's液配成1∶（2～4）。

3.15% SRBC悬液 取SRBC，用生理盐水洗3次（每次1500r/min，离心10分钟），最后一次以2500r/min离心15分钟，取SRBC配成15% SRBC悬液。

4.载玻片小室的制作　取洁净（无油）的载玻片，按下图（图1-8-1）粘三条透明胶带，在胶带上薄涂一层凡士林（勿涂到小室内），然后用镊子取两个盖片，分别放在其上，制成两个小室。用镊子尾端将盖片压平贴牢（保持小室一定体积）。用凡士林将盖片底端（其中的任一端）封住，顶端注入细胞混合液。

5.加样

1×107/ml脾细胞悬液　　0.2ml

15% SRBC　　0.2ml

补体〔1∶（2～4）稀释〕　　0.2ml

Hank's液　　1ml

混匀，用100μl的微量加样器吸取被检细胞悬液，于小室开口一端轻轻将液体注满小室（勿使气泡产生，勿使液体外溢），记录实际注入的细胞悬液微升数（约70μl），每个样品注2个小室，取其平均值。然后以凡士林或石蜡封口，放于37℃培养箱内1～1.5小时，取出观察结果。

实验结果

（1）肉眼观察空斑，计数1个小室出现的溶血空斑数。对模糊不清的空斑，可放在低倍镜下观察。真正的溶血空斑，中心有1个淋巴细胞，周围为透明区。

（2）计算全脾中抗体产生细胞数。

全脾中抗体产生细胞数可按照下述公式计算：

抗体产生细胞数=脾细胞悬液总毫升数/注入小室内的脾细胞毫升数×标本空斑数

注意事项

（1）小室注入液体不能留有气泡。

（2）小室边缘须用凡士林、石蜡封严。

（3）放于37℃温箱培养时必须放平，不可倾斜。

三、NK细胞活性测定

实验目的

1.熟悉　NK细胞活性测定的操作及原理。

2.了解　NK细胞活性测定的临床意义。

基本原理

NK细胞即自然杀伤细胞，是一类能非特异地杀伤肿瘤细胞、病毒的细胞，甚至能杀伤某些正常细胞的淋巴样细胞。它无须预先致敏，也不需要抗体的参与。NK细胞在杀伤靶细胞时不受MHC限制，与特异性CTL的识别机制不同。在抗肿瘤、抗病毒感染及免疫调节等方面发挥着重要作用。

本次测定NK细胞的活性是采用非同位素的方法。非同位素的方法有乳酸脱氢酶释放法及台盼蓝染色法，本次实验主要介绍台盼蓝染色法。

实验材料

（1）靶细胞（用K562细胞制备）。

（2）RPMI 1640培养液，按说明配制。

（3）0.5%台盼蓝染液、等渗盐水。

（4）超净台、倒置显微镜、水浴箱、离心机、计数板、小鼠、手术剪和镊子等。

实验方法

（1）制备靶细胞：取传代24小时K562细胞，用RPMI 1640培养液调至所需浓度。

（2）制备效应细胞：拉颈处死小鼠，无菌取脾脏，用镊子捣碎，悬于2ml培养液中，静置5分钟，取无沉渣液，或直接用纱布过滤，1500r/min离心10分钟，弃上清液，用3ml无菌蒸馏水崩解红细胞，40秒后用等渗盐水恢复等渗，2000r/min离心10分钟，弃等渗盐水，用等渗液调至所需浓度。

（3）取效应细胞和靶细胞各100μl，加入试管中（一般效靶比为50∶1或100∶1以上），用RPMI 1640培养液补至1ml，此为试验试管；另设对照试管（仅有效应细胞和PBS或靶细胞和PBS）置37℃水浴2小时。加1滴0.5%台盼蓝染液染色，立即观察结果。

实验结果

（1）死细胞呈蓝色，肿胀变大，失去光泽性。

（2）NK细胞杀伤百分率。

镜下计数200个靶细胞，求出死细胞百分率：

注意事项

（1）需用状态良好的靶细胞，一般传代时间超过两个月的K562细胞应弃去，再重新复苏。

（2）效靶细胞混合要充分。

（3）实验中必须设置对照管。

（4）效靶比例要适当，避免出现假阳性。

（5）实验所用台盼蓝浓度不能过高，染色时间不宜过长，以防造成细胞死亡，影响实验的精确性。