实验四　免疫标记技术

一、免疫酶标记技术

免疫酶标记技术是一种用酶标记抗体（或抗原）检测特异性抗原（或抗体）的方法。它将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。本法灵敏度高，特异性强，可检测可溶性抗原或抗体，也可检测组织或细胞表面特异性抗原。免疫酶标记技术已成为目前使用最多的一类免疫学实验技术，应用范围遍及医学和生物学科的各个领域。

（一）免疫组织化学技术（SABC-过氧化物酶法测TGF-β）

免疫组织化学技术（免疫组化）是免疫酶标记技术之一。免疫组织化学技术是应用抗原与抗体特异性结合的原理，检测组织细胞内多肽、蛋白质等大分子物质的分布。

实验目的

1.熟悉　免疫组织化学技术的基本原理，免疫组织化学技术在临床中的应用。

2.了解　免疫组织化学技术操作步骤。

基本原理

通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，形成抗原-抗体复合物；此复合物上带有事先标记的过氧化物酶，通过过氧化物酶与相对应的底物反应进行检测，如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。

实验材料

即用型TGF-β免疫组化试剂盒（SABC-过氧化物酶法）（试剂盒内有免抗TGF-β、生物素化山羊抗兔IgG、5%BSA封闭液、SABC试剂等），病理切片（大鼠阿霉素肾病模型），枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0，0.01mol/L），PBS缓冲液（pH7.2～7.6，0.01mol/L），二甲苯，苏木素染液，无水乙醇，95%乙醇，80%乙醇，蒸馏水，3%H2O2，DAB显色液（二氨基联苯胺），微量移液器，中性树胶，显微镜，电炉等。

实验方法

（1）病理切片用二甲苯常规脱蜡（3个杯子，每杯15分钟），经无水乙醇洗去二甲苯（10分钟），先后加入95%乙醇（10分钟）、80%乙醇（10分钟），蒸馏水冲洗。

（2）3%H2O2（30%H2O21份和蒸馏水9份混合），室温5～10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。

（3）热修复抗原：将病理切片浸入枸橼酸盐缓冲液，用电炉加热至沸腾后断电，间隔5～10分钟（维持缓冲液体系的容积不变），重复1～2次。自然冷却，PBS缓冲液冲洗后进行下一步（也可用高压蒸汽法修复）。

（4）滴加5%BSA封闭液，室温20分钟。甩去多余液体，不洗。

（5）滴加兔抗TGF-β，37℃，1～2小时。PBS缓冲液洗2分钟，重复3次。

（6）滴加生物素化山羊抗兔IgG，20～37℃，20分钟。PBS缓冲液洗2分钟，重复3次。

（7）滴加SABC试剂，20～37℃，20～30分钟。PBS缓冲液洗5分钟，重复4次。

（8）DAB显色。室温下取1ml蒸馏水，加DAB显色液，暗环境下显色，镜下控制反应时间，5～30分钟（一般10分钟）；或待镜下观察阳性细胞细胞质染色呈棕黄色，阴性细胞无色时，蒸馏水洗涤终止反应。

（9）苏木素染液轻度复染。

（10）常规脱水（低到高），透明，中性树胶封固。

（11）显微镜观察。

实验结果

TGF-β抗原在肾小球细胞的细胞质中表达，细胞的细胞质染为棕黄色，为阳性结果。

注意事项

（1）实验出现假阳性：病理切片质量不佳，造成假象，如刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作为判断阳性的依据。出血和坏死，红细胞的内源性过氧化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化物酶均可出现假阳性反应。抗体的交叉反应亦可引起假阳性。

（2）实验出现假阴性：固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。固定液不合适或浓度不对，容易导致固定不佳，最好使用10%中性福尔马林。抗体浓度过低，孵育时间太短，或孵育温度太低。缓冲液pH不正确等。

（3）DAB有致癌性，操作过程中应严格按实验操作规则操作，DAB用后不应随处丢弃。

临床意义

免疫组织化学技术特异性强、敏感度高、发展迅速、应用广泛，目前已成为生物学和医学众多学科的重要研究手段，尤其在肿瘤病理诊断中成为最重要的辅助手段之一。

（二）酶联免疫吸附试验（ELISA）——双抗体夹心法测乙型肝炎病毒表面抗原

酶联免疫吸附试验（ELISA）是免疫酶标记技术之一。ELISA是一种用酶标记抗原或抗体，在固相反应板上进行抗原抗体反应，通过酶催化底物显色测定抗原或抗体的方法。该法将抗原抗体反应的特异性与酶促反应的高效性和显色性有机地结合起来，ELISA具有特异性强、敏感度高、操作简便、易于观察、易于标准化等优点。ELISA的反应类型较多，常用的有双抗体夹心法、间接法、竞争法等。本实验以检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的双抗体夹心法为例。

实验目的

1.掌握　酶联免疫吸附试验的原理。

2.熟悉　酶联免疫吸附试验的结果判定及应用。

3.了解　酶联免疫吸附试验的操作方法。

基本原理

将抗体或抗原吸附到固相载体（聚苯乙烯微量反应板）孔表面，同时保持其免疫活性。将抗原或抗体与酶（辣根过氧化物酶）联结而制成酶标记抗原或酶标记抗体，同时保持其免疫活性和酶活性。将待检标本加入包被有已知抗体的聚苯乙烯微量反应板的孔中，使标本中的抗原与反应板孔表面的相应抗体结合，再加入酶标记抗体，形成已知抗体-标本中抗原-酶标记抗体复合物，最后加入酶的底物（邻苯二胺）。结合在复合物上的酶与相应底物反应形成有色的产物。可根据颜色深浅程度定量抗原。

实验材料

96孔聚苯乙烯微量反应板，碳酸盐缓冲液（pH 9.6，0.05mol/L），乙型肝炎病毒表面抗原免疫血清（抗-HBs），酶标记抗-HBs抗体，HBsAg阳性血清，待检样品，0.05%吐温-20磷酸缓冲液，邻苯二胺溶液，2mol/L硫酸溶液，生理盐水，微量移液器，酶标仪，37℃培养箱等。

实验方法

1.用抗-HBs包被微量反应板　将0.2ml抗-HBs加入10ml包被碳酸盐缓冲液，按每孔0.1ml包被96孔聚苯乙烯微量反应板，4℃冰箱过夜。

2.洗板　倒掉反应板孔中的液体，用洗涤液注满反应板孔，放置3分钟后弃去，如此反复清洗3次，最后在滤纸或纱布上将孔中剩余液体拍净。也可使用全自动洗板仪洗板。

3.加待检样品　每板设一个阳性对照和一个阴性对照。阳性对照孔加HBsAg阳性血清，阴性对照孔加生理盐水，其余各孔均加待检样品。每孔加0.1ml，37℃培养箱温育1小时。

4.洗板　操作同前。

5.加酶标记抗-HBs抗体　将酶标记抗-HBs抗体0.2ml，加入0.05%吐温-20磷酸缓冲液8ml，混匀，每孔0.1ml，37℃培养箱温育1小时。

6.洗板　操作同前。

7.加底物　每孔加入邻苯二胺溶液0.1ml，37℃培养箱温育30分钟。

8.终止反应　每孔加入2mol/L硫酸溶液0.1ml，终止酶反应。

9.观察　观察显色情况或测定490nm的OD值。

实验结果

肉眼观察，阳性对照孔应呈现棕黄色，阴性对照孔无色。反应孔若出现棕黄色为阳性结果，反之为阴性。也可用酶标仪进行测量，打印OD值或阴性、阳性结果。

注意事项

（1）操作前按试剂说明书对实验条件有充分的了解，如环境温度、温育温度、温育时间、洗涤次数等。

（2）正确使用微量移液器，微量移液器应垂直加入标本或试剂，不可刮擦包被板底部。加样过程中避免液体外溅，血清残留在反应孔壁上，微量移液器吸头要清洗干净，避免污染，加样次序要与说明书一致，尽可能减少实验重复性误差。

（3）手工洗板时，加洗液时冲击力不可过大，洗涤次数应严格按说明书推荐的次数洗涤，洗板时间不可太长。避免洗液外溢其他反应孔以免造成孔间污染，出现假阴性或假阳性。

（4）要保证加液量一致，避免因加液量不准造成显色不统一，错误判断结果。

（5）加样的环境不可处于阳光直射的环境，显色要避光，加显色液量严格按说明书执行。

（6）ELISA试剂盒应妥善保存于4℃冰箱内，每次实验前先平衡至室温，试剂开启后要在1周内用完，剩余的试剂下次用时应先检查是否变质，不同批号的试剂不可交叉使用。

临床意义

ELISA特异性强、敏感度高、操作简便，常用于体液中的微量抗原或抗体检测，临床广泛应用于血清抗体、病毒和多种细菌等的检测。

二、免疫荧光技术

免疫荧光技术是将抗原抗体特异性结合与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法［常用荧光素为异硫氰酸荧光素（FITC）］。由于荧光素发出的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。常用免疫荧光技术有直接免疫荧光技术和间接免疫荧光技术。本次试验介绍直接免疫荧光技术。

实验目的

1.熟悉　直接荧光免疫技术的基本原理。

2.了解　直接免疫荧光技术的临床意义。

基本原理

先在已知的抗体上标记荧光素制成荧光标记物，直接与相应抗原标本反应，使用荧光显微镜观察标本，荧光素受到显微镜激发光的照射而发出荧光（黄绿色或橘红色），当看到荧光及其位置，即可确定抗原的性质、定位等。免疫荧光技术操作简便、特异性高，但目前非特异性染色问题尚未完全解决，所以其灵敏度相对较差。

实验材料

荧光显微镜及影像采集系统，切片机，荧光素标记的抗体溶液，PBS缓冲液（pH 7.4，0.01mol/L），甘油缓冲液（甘油9份+pH 9.2的0.2mol/L碳酸盐缓冲液1份配制），搪瓷盒，载玻片等。

实验方法

（1）滴加PBS缓冲液于待检标本切片上，10分钟后弃去液体，使标本保持一定湿度。

（2）滴加适当稀释的荧光素标记的抗体溶液，使其覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（室温，30分钟为宜）。

（3）取出标本切片，置载玻片架上，先用PBS缓冲液冲洗后，再按顺序经过PBS缓冲液三缸浸泡，每缸浸泡3～5分钟。

（4）取出标本切片，用滤纸吸去多余水分，不可让标本切片完全干燥，加1滴甘油缓冲液，以载玻片覆盖。

实验结果

荧光显微镜下观察荧光的部位及强度。

-：无荧光。

±：极弱的可疑荧光。

+：荧光较弱，但清晰可见。

++：荧光明亮。

+++～++++：荧光闪亮。

当特异性荧光强度达“++”以上，而各种对照显示为“±”或“-”，即可判定结果为阳性。

注意事项

（1）对荧光素标记的抗体的稀释，要保证抗体蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1∶20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果。

（2）染色的条件需要根据各种不同的标本及抗原而变化（详见说明书），染色时间一般为30分钟，染色温度多为室温，当温度超过37℃可非特异性加强染色效果，低温染色过夜比室温30分钟效果好。

（3）通常情况下标本在高压汞灯下照射超过3分钟，就会发生荧光减弱现象，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降，所以经荧光染色的标本最好在当天检测观察。

临床意义

免疫荧光技术操作简便、特异性高，目前已广泛用作自身免疫性疾病、病毒、细菌和寄生虫等的检验诊断。