第一篇 食品生物技术基础类实验
第一章 生物化学实验
模块一 验证性实验
实验一 蛋白质的提取
一、实验目的
学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法，加深对等电点概念的理解。
二、实验原理
牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是以酪蛋白酸钙—磷酸钙复合体胶粒存在，胶粒直径为20～800nm，平均为100nm。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。本实验利用加酸，当达到酪蛋白的等电点pI=4.7时，酪蛋白沉淀。用乙醇、乙醇—乙醚混合物、乙醚来洗涤沉淀物，以去除醇溶性和脂溶性杂质，就可得到较纯的酪蛋白。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
牛乳。
2.仪器
离心机、恒温水浴锅、抽滤装置、烧杯、温度计、精密试纸pH 4.7、玻璃棒、三角瓶、量筒。
3.试剂
（1）95%乙醇1200mL。
（2）无水乙醚1200mL。
（3）乙醇—乙醚混合液=1∶1（体积分数）2000mL。
（4）2mol/L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲溶液3000mL。
先配置A液与B液。
A液（0.2mol/L醋酸钠溶液）：称取NaAc·3H2O 54.44g，定容至2000mL。
B液（0.2mol/L醋酸溶液）：称取优级纯醋酸（含量＞99.8%）12.0g，定容至1000mL。
取A液1770mL，B液1230mL，混合即得p H4.7的醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL。
四、实验步骤
（1）将40mL牛乳加热至40℃，边搅拌边向烧杯中慢慢加入预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液40mL，用精密试纸或酸度计调pH至4.7。
（2）将上述悬浮液冷至室温。3000r/min离心15min，沉淀为酪蛋白粗制品。
（3）用水洗沉淀3次，每次洗后3000r/min离心10min，弃去清液。
（4）在沉淀中加入约10mL乙醇，搅拌，将悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。
（5）将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白纯品。
五、结果与讨论
准确称重，计算含量和得率，如式（1-1）、式（1-2）所示。
式中 m——酪蛋白质量，g；
V——牛乳体积，mL。
式中，理论含量为3.5g/100mL牛乳。
六、注意事项
（1）离心管装入样品后必须严格配平，否则对离心机损坏严重。
（2）离心管装入样品后必须盖严，擦干表面的水分和污物后方可放入离心机。
（3）离心机用完后应拔下电源，然后检查离心腔中有无水迹和污物，擦除干净后才能盖上盖子放好保存，以免生锈和损坏。
思考题
1.为什么调整溶液的pH可以将酪蛋白沉淀出来？
2.制备高得率纯酪蛋白的关键是什么？
3.试设计一个利用蛋白质其他性质提取蛋白质的实验。
参考文献
[1]王秀奇，秦淑媛，高天慧，等．基础生物化学实验[M]. 2版．北京：高等教育出版社，1999.
[2]陈钧辉，袁道强，陈世锋．生物化学实验[M].2版．北京：科学出版社，2003.
实验二 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
一、实验目的
掌握醋酸纤维薄膜电泳的原理和方法。
二、实验原理
采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维薄膜电泳。该法简单、快速、样品量少、区带清晰、灵敏度高、便于照相和保存。广泛用于血清蛋白、球蛋白、血红蛋白、脂蛋白、糖蛋白、类固醇、同工酶的分离与鉴定。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
未溶血的人或动物血清、镊子、玻璃板直尺和铅笔、醋酸纤维薄膜（2cm×8cm）。
2.仪器
点样器、电泳仪、电泳槽。
3.试剂
（1）巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH 8.6，离子强度0.07）5000mL 13.8g巴比妥，77.25g巴比妥钠，加热溶解，冷后稀释至5000mL，置4℃保存。
（2）染色液（氨基黑10B）500mL 1.25g氨基黑，200mL水，250mL甲醇，50mL冰乙酸（可重复使用）。
（3）漂洗液1000mL 450mL 95%乙醇，50mL冰乙酸，500mL水。
（4）透明液1000mL（用前配制）300mL冰乙酸，700mL无水乙醇。
（5）0.4mol/L氢氧化钠溶液。
四、实验步骤
（1）浸泡 用镊子取醋酸纤维薄膜1张，（识别出光泽面与无光泽面，并在角上做上记号）放在缓冲液中浸泡20min。
（2）点样 取出薄膜夹在滤纸中吸取多余水分，无光面朝上铺于玻板上，将点样器在血清中蘸一下，再在薄膜一端2～3cm处轻轻地水平落下并随即提起（先在滤纸上练习）。
（3）电泳 电泳槽中倒上缓冲液，桥头铺滤纸，滤纸一端浸入缓冲液，驱除滤纸条上的气泡。薄膜样点端在负极，无光面朝下放于滤纸桥上。盖严电泳室，调节电压160V，电流强度0.4～0.7mA/cm膜宽，电泳25min。
（4）染色 取出膜条浸于染色液10min。
（5）漂洗 取出膜条在漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止。
定量测定时可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开，分别浸在0.4mol/L氢氧化钠液中30min，并剪取相同大小的无色带膜条做空白对照，在650nm进行比色。或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2～3min后取出贴于洁净玻璃板上，干后即为透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。
五、结果与讨论
电泳图谱如图1-1所示。
图1-1 电泳薄膜图谱
六、注意事项
（1）点样要少、轻、直、匀。
（2）不要将薄膜吸得过干。
（3）漂洗时不要用镊子来回拉动。
（4）节约漂洗液。
思考题
1.用醋酸纤维薄膜作电泳支持物有什么优点？
2.电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？
参考文献
[1]王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学[M].北京：高等教育出版社，2002.
[2]Robert H. Glew，Miriam D. Rosenthal. Clinical studies in medical biochemistry[M]. 3rd ed. Oxford University Press，2007.
[3]李巧枝，程绎南．生物化学实验技术[M].北京：中国轻工业出版社，2010.
实验三 蛋白质的性质-—等电点、沉淀、变性和呈色反应
内容一 蛋白质等电点测定
一、实验目的
了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
二、实验原理
蛋白质的分子质量很大，它能形成稳定均一的溶液，主要是由于蛋白质分子都带有相同符号的电荷，同时蛋白质分子周围有一层溶剂化的水膜，避免蛋白质分子之间聚集而沉降。
蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中成阳离子，在碱性溶液中成阴离子（图1-2）。
图1-2 溶液中蛋白质分子在不同pH时的带电情况及在电场中的行为
蛋白质分子所带净电荷为零时的pH称为蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，这时蛋白质溶液的黏度、渗透压均降到最低，且溶液变混浊。若再加入一定量的溶剂如乙醇、丙酮，与蛋白质分子争夺水分子，降低蛋白质水化层的厚度而使混浊更加明显。
各种蛋白质的等电点都不相同，偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的pI为4.7～4.8，血红蛋白的pI为6.7～6.8，胰岛素pI为5.3～5.4，鱼精蛋白是一种碱性蛋白质，其等电点为12.0～12.4。蛋白质的pI可以用等电聚焦电泳准确测定。本实验采用蛋白质在不同pH溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的pH即为该种蛋白质的等电点，这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作简便。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
试管：ϕ1.5cm 9支；吸管：1、2、10mL各2支；容量瓶：50mL 2个、500mL 1个。
2.仪器
水浴锅、温度计。
3.试剂
（1）0.4%酪蛋白醋酸钠溶液 称取酪蛋白2g，放在烧杯中，加入40℃的蒸馏水。加入50mL 1.00mol/L氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。将溶解好的蛋白质溶液转移到500mL容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。在容量瓶中再加入100mol/L醋酸溶液50mL，摇匀。加入蒸馏水定容至500mL，得0.1mol/L酪蛋白醋酸钠溶液。
（2）0.01mol/L醋酸溶液50mL。
（3）0.10mol/L醋酸溶液100mL。
（4）1.00mol/L醋酸溶液100mL。
（5）1.00mol/L氢氧化钠溶液50mL。
四、实验步骤
取同样规格的试管4支，按表1-1顺序准确地加入各试剂，加入后立即摇匀。观察各管产生的混浊并根据混浊度来判断酪蛋白的等电点，最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。观察时可用+、++、+++表示混浊度。
表1-1 酪蛋白等电点测定
五、结果与讨论
酪蛋白的等电点为多少？为什么？
六、注意事项
4支试管加入试剂时需要准确。
思考题
1.在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。
2.本实验中，酪蛋白在等电点时从溶液中沉淀析出，所以说凡是蛋白质在等电点时必然沉淀出来。这种结论对吗？为什么？
3.在分离蛋白质时等电点有何实际应用意义？
参考文献
[1]王秀奇，秦淑媛，高天慧，等．基础生物化学实验[M].2版．北京：高等教育出版社，1999.
[2]李可群．利用对分法求取蛋白质等电点[J].思茅师范高等专科学校学报，2009，25（3）：41-42.
[3]李可群．一种蛋白质等电点的简便计算方法[J].曲靖师范学院学报，2009，28（3）：25-28.
内容二 蛋白质的沉淀反应
一、实验目的
加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识，了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义，了解蛋白质变性与沉淀的关系。
二、实验原理
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
1.可逆的沉淀反应
此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并可保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。
2.不可逆沉淀反应
此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此，变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
试管：ϕ1.5cm 9支；吸管：1、2、10mL各2支；容量瓶：100、500mL各1个；胶头滴管2支；量筒：100、500mL各1个。
2.仪器
水浴锅、温度计、天平、试管架。
3.试剂
（1）蛋白质溶液500mL 5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清∶水=1∶9）。
（2）pH 4.7醋酸—醋酸钠的缓冲溶液100mL。
（3）3%硝酸银溶液10mL。
（4）5%三氯乙酸溶液50mL。
（5）95%乙醇250mL。
（6）饱和硫酸铵溶液250mL。
（7）硫酸铵结晶粉末500g。
（8）0.1mol/L盐酸溶液300mL。
（9）0.1mol/L氢氧化钠溶液100mL。
（10）0.05mol/L碳酸钠溶液100mL。
（11）0.1mol/L醋酸溶液100mL。
（12）甲基红溶液20mL。
（13）2%氯化钠溶液150mL。
（14）2%醋酸50mL。
（15）20%磺基水杨酸溶液50mL。
四、实验步骤
（1）蛋白质的盐析 无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，沉淀又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。
加5%卵清蛋白溶液5mL于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察沉淀是否溶解，为什么？将管中内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。
取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。
（2）重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。
取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加3%硝酸银溶液1～2滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，观察沉淀是否溶解，为什么？
（3）某些有机酸沉淀蛋白质 取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加1mL 5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。
（4）有机溶剂沉淀蛋白质 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL 95%乙醇。混匀，观察沉淀的生成。
（5）乙醇引起的变性与沉淀 取3支试管，编号。按表1-2顺序加入试剂。
表1-2 乙醇引起的变性与沉淀
振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水8mL，然后在三支管中各加一滴甲基红，再分别用0.1mol/L醋酸溶液及0.05mol/L碳酸钠溶液中和2、3号两支试管。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1mol/L盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。
（6）尿蛋白的定性检验 正常人尿中只含有微量蛋白质，不能用常规方法测定出来。用临床常规方法能检查出蛋白质的尿称为蛋白尿。患肾脏疾病的人（如患肾小球肾炎、肾盂肾炎）往往有蛋白尿，因此，尿中蛋白质的检查在临床上具有重要的诊断意义。
①加热醋酸法：尿中的蛋白质加热变性后溶解度降低，因此可以被沉淀出来，加入醋酸使尿液呈弱酸性后，蛋白质仍不易溶解，但因加热引起的磷酸盐混浊则在加入醋酸后消失，故二者可以区别。
取尿液3mL置于试管中，加热至沸腾（应在火焰上移动试管，严防尿液喷出）。观察有无沉淀产生。若产生沉淀，则加入2%醋酸数滴使溶液显酸性，然后观察沉淀情况。按表1-3记录结果。
表1-3 加热醋酸法结果与尿中蛋白质的浓度的关系
②磺基水杨酸法：利用有机酸沉淀蛋白质，是临床常用的方法。此法较“加热醋酸法”更为灵敏，尿中蛋白质浓度为0.0015%即可检出。
a.取尿约3mL加入试管中。
b.加入20%磺基水杨酸8～10滴，如出现沉淀，表示尿中有蛋白质存在。参考表1-3，按沉淀多少记录结果。
五、结果与讨论
记录实验结果，解释各部分实验发生的全部现象。
六、注意事项
乙醇引起的变性与沉淀部分：用0.1mol/L醋酸溶液中和2号试管及0.05mol/L碳酸钠溶液中和3号试管，观察各管颜色的变化和沉淀的生成。重点是观察沉淀的生成，颜色的变化用于判断pH。
思考题
1.如何从低分子质量的胺类化合物（非蛋白质的化合物）分离出蛋白质？
2.鸡蛋清为何可作铅、汞中毒的解毒剂？
3.氯化汞为何能作杀菌剂？
4.沉淀、变性之间有什么样的关系？哪些沉淀往往伴随变性？
5.有机酸（如三氯乙酸）沉淀蛋白质有无实际应用意义？
6.有机溶剂是否一定引起蛋白质发生变性？
参考文献
王秀奇，秦淑媛，高天慧，等．基础生物化学实验[M].2版．北京：高等教育出版社，1999 .
内容三 蛋白质的呈色反应
一、实验目的
（1）了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。
（2）了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
（3）学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
二、实验原理
1.双缩脲反应
双缩脲反应过程如图1-3所示。
图1-3 双缩脲反应
尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出1分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应，蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。
双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有1个肽键和1个—CS—NH2、—CH2—NH2、—CRH—NH2、—CH2—NH2—CH2—NH2—CH2OH或—CHOHCH2NH2等基团的物质以及含有乙二酰二胺等物质也有此反应。NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
2.茚三酮反应
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
β—丙氨酸、氨和许多一级胺都对茚三酮呈正反应。尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。
该反应十分灵敏，1∶1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成二氧化碳、氨气和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。
此反应的适宜pH为5～7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
3.黄色反应
黄色反应过程如图1-4所示。
图1-4 黄色反应
含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。
三、实验材料、仪器与试剂
（一）双缩脲反应
1.材料
牛乳。
2.仪器
吸头、试管。
3.试剂
（1）尿素。
（2）10%氢氧化钠溶液1000mL。
（3）1%硫酸铜溶液500mL。
（4）2%卵清蛋白溶液（可用牛乳代替）。
（二）茚三酮反应
1.材料
新鲜鸡蛋（牛乳）、甘氨酸。
2.仪器
试管、吸头、滤纸。
3.试剂
（1）蛋白质溶液2%卵清蛋白或鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）（牛乳）。
（2）0.5%甘氨酸溶液500mL。
（3）0.1%茚三酮水溶液500mL。
（4）0.1%茚三酮乙醇溶液500mL。
（三）黄色反应
1.材料
新鲜鸡蛋、大豆、头发、指甲。
2.仪器
纱布、研钵、试管、吸头。
3.试剂
（1）鸡蛋清溶液（牛乳）100mL将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1∶20混匀，然后用6层纱布过滤。
（2）大豆提取液1000mL将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状再用纱布过滤。
（3）0.5%苯酚溶液100mL。
（4）浓硝酸200mL。
（5）0.3%色氨酸溶液100mL。
（6）0.3%酪氨酸溶液100mL。
（7）10%氢氧化钠溶液200mL。
四、实验步骤
1.双缩脲反应
取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷却后，加10%氢氧化钠溶液约1mL，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。
向另一试管加牛乳约1mL和10%氢氧化钠溶液约2mL，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。
2.茚三酮反应
（1）取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1mL，再各加0.5mL 0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1～2min，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。
（2）在一小块滤纸上滴1滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴1滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。
3.黄色反应
向7支试管中分别按表1-4加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。
表1-4不同材料的黄色反应
五、结果与讨论
（1）双缩脲反应 双缩脲反应结果可填入表1-5。
表1-5 双缩脲反应结果
（2）茚三酮反应 茚三酮反应结果可填入表1-6。
表1-6 茚三酮反应结果
（3）黄色反应 黄色反应结果可填入表1-7。
表1-7 黄色反应结果
六、注意事项
（1）茚三酮反应必须在pH为5～7进行。
（2）操作请按步骤进行。
思考题
通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法？它们的原理分别是什么？
参考文献
[1]王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学[M].北京：高等教育出版社，2002.
[2]李巧枝，程绎南．生物化学实验技术[M].北京：中国轻工业出版社，2010.
实验四 酵母蔗糖酶的提取、分离纯化及性质鉴定
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，又称为生物催化剂。生物体内的所有化学反应，几乎都是在酶的催化下进行的，因此酶学的研究，对于了解生命活动的规律、阐明生命现象的本质以及指导相关的医学实践、工业生产都有重要的意义。
蔗糖酶（sucrase，EC 3.2.1.26）又称为转化酶（invertase）。蔗糖在蔗糖酶的作用下水解为D—葡萄糖和D—果糖。按照水解蔗糖的方式蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的呋喃果糖苷酶和从葡萄糖末端切开蔗糖的葡萄糖苷酶。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。通常所讲的蔗糖酶是指分解蔗糖中果糖糖苷键的酶。
蔗糖酶主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌、植物中，但工业上通常从酵母中制取。这是古老的酶制剂之一，很久以前就用来作为酶化学的研究材料，很多有关酶的基础知识都是通过蔗糖酶的研究取得的。
酵母蔗糖酶是胞内酶，提取时需破碎细胞。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、离子交换和凝胶柱层析等。可得到较高纯度的酶，但高纯度的酶大多很不稳定，大多商品酶为粗酶溶解于甘油的液状制品。也可将蔗糖酶同单宁酸相结合得到极稳定的固定化酶。
蔗糖酶在食品工业中，用以转化蔗糖增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，还可用来制造果糖和巧克力的软糖心等。
内容一 酵母蔗糖酶的提取及分离纯化
一、实验目的
（1）学习并掌握蛋白质和酶的基本研究过程。
（2）掌握生物大分子的提取、分离纯化的方法。
（3）掌握有机溶剂分级沉淀。
二、实验原理
1.细胞破壁
蔗糖酶是胞内酶，必须破坏细胞，将其从细胞内释放出来。细胞破壁方法如下所述。
（1）高速组织捣碎 将材料配成稀糊状，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，再开动开关，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质、种子等。
（2）玻璃匀浆器匀浆 先将剪碎的组织置于管中，再套入研杵来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量的动物脏器组织。
（3）超声波处理法 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧振荡破裂，此法多适用于微生物材料，常选用50～100mg菌体/mL浓度，在30～60Hz频率下处理10～15min，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应的降温措施。对超声波敏感的核酸应慎用。
（4）反复冻融法 将细胞在-20℃以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒的形成和剩余细胞液的盐浓度增加引起溶胀，使细胞结构破碎。
（5）化学处理法 有些动物细胞，如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等将细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。
2.有机溶剂分级沉淀
利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中溶解度的差异分离酶蛋白的方法称作有机溶剂分级沉淀法。有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的下降；有机溶剂与水作用，还能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中可沉淀析出。操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度以减少其变性，提高分离效果。与盐析法相比，该法的分辨率高，但易使酶变性失活。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
活性干酵母。
2.仪器
试管、恒温水浴槽、离心机、透析袋。
3.试剂
（1）氢氧化钠、盐酸、95%乙醇。
（2）起始缓冲液5mmol/L磷酸钠缓冲液（pH 6.0）。
四、实验步骤
蔗糖酶的分离提纯。
（1）蔗糖酶粗品的制备 细胞破碎：采用细胞自溶法，取20g高活性干酵母粉倒入烧杯中，少量多次加入50mL去离子水，搅拌成糊状后，加入2g乙酸钠、30mL乙酸乙酯，搅匀。再于35℃温水浴中搅拌30min，补加去离子水30mL，搅匀。用硫酸纸封严，于35℃恒温过夜。4℃下8000r/min离心10min，取上清液，得到无细胞抽提液（自溶破壁的酶液位于中层），量出粗酶液的体积V1，粗酶液保存于4℃冰箱，待测蛋白质浓度和蔗糖酶活力。
（2）乙醇分级 将1/2粗酶液用稀乙酸调pH至4.5，其余1/2粗酶液冷冻保存用于蛋白质浓度和蔗糖酶活力测定等。
第一次乙醇沉淀（乙醇终浓度为32%）：计算出使粗酶液的乙醇浓度达32%时所需95%乙醇的体积；把粗酶液和量好的乙醇在冰水浴中预冷，缓慢滴加乙醇并不断搅拌。滴加结束后，4℃，8000r/min离心5min，留取上清液。
第二次乙醇沉淀（乙醇终浓度为47.5%）：计算出使粗酶液中乙醇浓度达47.5%时所需补加95%乙醇的体积；按上述方法加入乙醇后于4℃，8000r/min离心10min，沉淀立刻用10～15mL起始缓冲液溶解并对该溶液透析过夜。次日，离心（4℃，8000r/min，5min）得酶液，量出体积V2，取出适量酶液保存于4℃冰箱，待测蛋白质浓度和蔗糖酶活力。
五、结果与讨论
记录实验结果，并加以解释，若有异常现象，可进行分析讨论。
六、注意事项
离心前一定要平衡，并对称放入，盖好盖子。
思考题
1.简述蔗糖酶分离提取的原理及操作步骤。
2.简述蔗糖酶活力测定的原理及两个反应。
3.在酶分离提纯的整个过程中应注意的一个关键问题是什么？
内容二 蔗糖酶活力的测定
一、实验目的
（1）学习3，5—二硝基水杨酸（DNS试剂）比色定糖的原理和方法。
（2）掌握酶的比活力测定及其计算方法。
（3）掌握分光光度计的使用方法。
二、实验原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中，乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其他产物，3，5—二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3—氨基-5—硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定吸光度，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。比活力是以每毫克酶蛋白含有的活力单位数表示。规定：在pH 4.6，35℃，每分钟能使5%蔗糖溶液水解释放1mg还原糖的酶量定为一个活力单位。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
酵母蔗糖酶。
2.仪器
烧杯、搅拌棒、滴管、量筒、移液管、容量瓶、试管、血糖管（或刻度试管）、秒表、恒温水浴槽、电子天平、722型分光光度计。
3.试剂
（1）3，5—二硝基水杨酸试剂。
（2）1mol/L氢氧化钠溶液。
（3）5%蔗糖溶液。
（4）1mg/mL葡萄糖标准液。
（5）pH 4.6，0.2mol/L乙酸缓冲液。
四、实验步骤
（1）标准曲线的制作 取7支试管编号，按表1-8的顺序加入各种试剂。
表1-8 标准曲线的制作
摇匀后，用空白管（0号）调零，在540nm处测定吸光度，以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A540值为纵坐标，做出标准曲线。
（2）蔗糖酶活力的测定 取两支试管分别加入用pH 4.6、0.2mol/L乙酸缓冲液适当稀释过的酶液2mL，一支中加入0.5mL 1mol/L氢氧化钠，摇匀，使酶失活（作对照），另一支作测定管：把两支试管和5%蔗糖溶液放入35℃水浴中恒温预热；分别取2mL 5%蔗糖加入上述两试管中，并准确计算时间，3min后于测定管中加入0.5mL 1mol/L氢氧化钠，摇匀，使酶失活。
从反应混合物中取出0.5mL溶液放入血糖管中，加入1.5mL 3，5—二硝基水杨酸试剂和1.5mL水，摇匀。于沸水浴中准确反应5min，立即用冷水冷却，加水稀释至25mL，摇匀，于540nm处测定吸光度。
乙醇沉淀前的粗酶液也需要测定酶活力，步骤同上。
五、结果与讨论
在葡萄糖标准曲线上找到所测定光密度值对应的葡萄糖含量，按式（1-3）计算酶活力。
数据处理方法：
其中 总活力=蔗糖酶活力×V
比活力=总活力/蛋白质总量
回收率=（每一步总活力/第一步总活力）×100%
纯化倍数=每一步比活力/第一步比活力
式中 m——测定管葡萄糖质量，mg；
n——稀释倍数；
V——酶液体积，mL
t——反应时间，min。
六、注意事项
（1）工作曲线的使用 不许延长，因为比耳定律只适用于稀溶液中的反应。
（2）测定酶活力时的显色反应
①等沸水浴锅中的水沸腾后再放入试管；
② 用秒表计时，取出后立即用冷水冷却，加蒸馏水定容至25mL，摇匀，测定540nm处的吸光度。
（3）酶是有生物活性的蛋白质，在整个实验过程中都要注意防止酶失活。
思考题
1.写出3，5—二硝基水杨酸的化学结构式。
2.分光光度计比色测定的基本原理是什么？操作要点是什么？
3.比色测定时为什么要设计空白管？
4.总糖包括哪些化合物？
参考文献
滕利荣，孟庆繁．生物学基础实验教程[M].3版．北京：科学出版社，2008.
实验五 氨基酸的分离鉴定及含量的测定
内容一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法
一、实验目的
通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、实验原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成。
物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用比移值（Rf移）来表示的，如式（1-4）所示。
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸，如图1-5所示。
图1-5 纸层析图谱
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
氨基酸。
2.仪器
层析缸、毛细管、喷雾器、培养皿、层析滤纸（新华一号）。
3.试剂
（1）扩展剂（2000mL）4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20mL正丁醇和5mL冰醋酸放入分液漏斗中，与15mL水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
（2）氨基酸溶液（各5mL）0.5%赖氨酸（紫色）、脯氨酸（黄色）、亮氨酸（紫色）溶液及它们的混合液（各组分浓度均为0.5%）。
（3）显色剂（1000mL）0.1%水合茚三酮正丁醇溶液（现配最好）。
四、实验步骤
（1）将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。
图1-6 点样
（2）取层析滤纸（长22cm、宽14cm）一张。在纸的一端距边缘2～3cm处用铅笔画一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号如图1-6所示。
（3）点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在这4个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。
（4）扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭（注意：一定要密闭，否则迁移不上去）的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm）。待溶剂上升15～20cm时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。
（5）显色 用毛刷洒下显色剂，喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5min（100℃）或用热风吹干即可显出各层析斑点。
五、结果与讨论
计算各种氨基酸的Rf值，如表1-9所示。
表1-9 纸层析结果
六、注意事项
（1）点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面（即展层时样品可能达到的部分）。
（2）点样斑点不能太大（直径应小于0.3cm），防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。
思考题
1.何谓纸层析法？
2.何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？
参考文献
[1]陈钧辉．生物化学实验[M].4版．北京：科学出版社，2006.
[2]郭蔼光，郭泽坤．生物化学实验技术[M].北京：高等教育出版社，2007.
内容二 纸电泳法分离氨基酸
一、实验目的
（1）掌握纸上电泳的原理。
（2）掌握纸上电泳的操作方法。
二、实验原理
带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳（electrophoresis）。电泳现象早在1808年就被发现，但是作为一项生物化学研究的方法学，却是在1937年Tiselius在电泳仪器方面取得重大成就后，才得到较大的进展。特别是后来应用滤纸作为支持物，形成了设备简单、操作方便的纸上电泳法后，电泳技术才在生物化学和其他领域研究中被广泛的应用和发展。近年来，由于采用多种新型支持物，仪器装置也得到不断改进，因此出现了许多新型的电泳技术。
目前所采用的电泳方法，大致可分为三类：显微电泳、自由界面电泳和区带电泳。区带电泳应用比较广泛，按其支持物物理性状的不同可分成4大类。
（1）滤纸及其他纤维（如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤维）薄膜电泳。
（2）凝胶电泳 如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶电泳。
（3）粉末电泳 如纤维素粉、淀粉、玻璃分电泳。
（4）线丝电泳 如尼龙丝，人造丝电泳。此为微量电泳方法。
区带电泳现已广泛应用于生物化学物质的分析分离以及临床检验等方面。现以纸上电泳为例介绍有关电泳的原理和操作技术。
任一物质质点，由于其本身的解离作用或由于表面上吸附有其他带电质点，在电场中便会向一定的电极移动。例如氨基酸、蛋白质分子等，由于它具有许多可解离的酸性基团和碱性基团，如—COO-和—NH3+等，它是一典型的两性电解质，在一定的pH条件下，就会解离而带电，带电的性质和多少决定于蛋白质分子的性质及其溶液的pH和离子强度。在某一pH条件下，蛋白质分子所带的正电荷数恰好等于负电荷数，即净电荷等于零。此时蛋白质质点在电场中不移动，溶液的这一pH，称为该蛋白质的等电点（pI）。如果溶液的pH小于pI，则蛋白质分子结合一部分H+，而带正电荷，在电场中就会向负极移动。反之，溶液的pH大于pI，则蛋白质分子会解离出一部分H+而带有负电，此时蛋白质分子在电场中就会向正极移动。如图1-7所示。
图1-7 溶液中蛋白质分子在不同pH时的带电情况
不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度不同，常用迁移率（或称泳动度，mobility）来表示。迁移率的定义是带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度，如式（1-5）所示。
式中 m——迁移率，cm2/（V·s）；
v——颗粒的泳动速度，cm/s；
E——电场强度，V/cm；
d——颗粒泳动的距离，cm；
L——滤纸的有效长度，cm，即滤纸与两极溶液交界面间的距离；
V——实际电压，V；
t——通电时间，s。
通过测量d、L、v、t便可计算出颗粒的迁移率。
带电颗粒在电场中的泳动速度与本身所带净电荷的量、颗粒的大小和形状有关。一般来说，所带净电荷量越多，颗粒越小，越接近球形，则在电场中的泳动速度越快，反之则越慢。泳动速度除受颗粒本身性质的影响外，还和其他外界因素有关。
现将影响颗粒泳动速度的外界因素讨论如下。
1.电场强度
电场强度是指每lcm的电位降，也称电位梯度（电势梯度）。电场强度对泳动速度起着决定性作用。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。例如进行纸上电泳时，滤纸两端相距20cm处测得电位降为200V，则电场强度为200/20=10V/cm。
纸上电泳根据电场强度的大小可分为常压（100～500V）纸上电泳和高压（2000～10000V）纸上电泳，前者电场强度一般为2～10V/cm，分离时间较长，从数小时到数天。后者电场强度为50～200V/cm，电泳时间很短；有时仅需数分钟。常压纸上电泳多用于分离蛋白质等大分子物质，高压纸上电泳则多用来分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。
2.溶液的pH
溶液的pH决定带电颗粒解离的程度，亦即决定其所带净电荷的多少。对蛋白质两性电解质而言，pH离等电点越远，则颗粒所带净电荷越多，泳动速度也越快，反之，则越慢。因此，当分离某一蛋白质混合物时，应选择一个合适的pH，使各种蛋白质所带的电荷量差异较大，有利于彼此分开。为了使电泳过程中溶液pH恒定，必须采用缓冲溶液。
3.溶液的离子强度
离子强度影响颗粒的电动电势（ξ），溶液的离子强度越高，电动电势越小，则泳动速度越慢；反之，则越快。一般最适的离子强度在0.02～0.2之间。溶液离子强度的计算方法如式（1-6）所示。
式中 I——溶液的离子强度；
C——离子的物质的量浓度；
Z——离子的价数。
4.电渗
在电场中，由于多孔支持物吸附水中的正或负离子，使溶液相对带电，在电场作用下，溶液就向一定方向移动，称为电渗现象（图1-8）。在纸上电泳中，由于纸上吸附OH-带负电荷，而与纸相接触的水溶液带正电荷，液体便向负极移动，移动时可携带颗粒同时移动。所以电泳时颗粒泳动的表面速度是颗粒本身的泳动速度与由于电渗影响而被携带的移动速度两者的加和。若是颗粒原来向负极移动，则其表观速度将比泳动速度快，若原来向正极移动，则其表观速度将比泳动速度慢。
图1-8 电渗示意图
为了校正这一误差，可用一中性物质如糊精（dextrin）、蔗糖或葡聚糖（dextran）等与样品平行做纸上电泳，然后将其移动距离自实验结果中除去。
5.滤纸的选择
要求纸质均匀和吸附力小，否则电场强度不均匀，使结果不能重复，并得不到好的图谱。如果吸附力大，则蛋白质或其他胶体在它们泳动的过程中有一部分被纸所吸附，以至于泳动快的部分其相对含量低。因此，常将滤纸事先处理，以减低滤纸的吸附能力，使其达到更好的分离效果。若选用国产新华滤纸，或Whatman No.1号滤纸，一般不必再进行预处理。
6.其他因素
例如缓冲溶液的黏度。缓冲溶液与带电颗粒的相互作用以及电泳时温度的变化等因素，也都影响泳动速度。
本实验以混合氨基酸为材料，用纸上电泳法分离其中的不同氨基酸。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
氨基酸。
2.仪器
水平式电泳槽、电泳仪、吹风机、点样器、喷雾器、铅笔、刀片、杭州新华滤纸或Whatman No.1号滤纸。
3.试剂
（1）1/15mol/L磷酸盐缓冲液（离子强度0.08，pH 6.0）5000mL。
（2）丙氨酸（pI=6.02）、谷氨酸（pI=3.22）、赖氨酸（pI=9.74）混合液（各1%）100mL。
（3）显色液（茚三酮）。
四、实验步骤
（1）仪器及样品的准备 将电泳槽洗净，晾干、放平。然后量取700～800mL缓冲液先倒入电泳槽，使两端液面达到平衡。
（2）滤纸的剪裁 用刀片将新华滤纸或Whatman No.1号滤纸，裁成长10cm、宽2cm的滤纸条，并按以下规格用铅笔作上正负记号（图1-9）。
图1-9 滤纸剪裁示意图
剪裁前要选择纸质比较均匀的纸，用刀片裁整齐，注意纸边不能有缺刻或起毛，可先用废纸条练习，然后再正式裁剪。
（3）点样
①原点的位置和形状：对于一个未知样品，初次实验时，应将样品点在滤纸条的中央，观察区带的两极泳动情况，即可选择出点样位置。
样品可点成长条形，或圆点状。一般长条形分离效果较好，但样品很少时，点成圆点，样品比较集中，便于显色。但双向电泳或一向电泳、一向层析结合使用时则必须点成圆点或椭圆点，不能点成长条形。
②点样量：随滤纸的厚度、原点的宽度、样品的溶解度、显色方法的灵敏度、样品迁移率的差异而有所不同。样品量过多时拖尾和扩散比较严重，不能获得最有效的分离。样品量太少时，将无法检出。
③点样方法：可分干点法和湿点法两种。
湿点法：先将滤纸用喷雾器均匀地喷上缓冲液，或将滤纸浸于缓冲液中，浸透后取出，夹在两普通滤纸中，轻压，将多余缓冲液吸去。缓冲液与干纸质量比为1.2∶（1～2.5）∶1。然后架起滤纸，在纸上用点样管将样品画成长条形。注意画线要直，且粗细均匀，千万不可将滤纸画毛，损伤纸面。以湿点法点样品时，点的次数不宜多，因此，如果样品浓度较低时，必须事先浓缩。
干点法：将样品点于纸上，待第一次样品晾干，再点第二次。画线必须细直，粗细均匀，直到将所需要的样品全部点完为止。可用吹风机冷风加速干燥，而后小心地用喷雾器将滤纸两端喷湿，有样品处空出，让其缓冲液经扩散而自行湿润，或将滤纸除样品部分外浸于缓冲液中，放置片刻，样品部分靠毛细管作用而湿润，多余缓冲液可用普通滤纸吸去。
干点法和湿点法各有利弊，干点法虽然在点样过程中起浓缩作用，但点的次数多时，纸面容易受损，样品干坏。湿点法虽不宜用作稀的样品，却可保持样品的天然状态。
点样前，可用废滤纸条先以水代替样品进行练习，当操作熟练后再正式点样。
（4）电泳 将滤纸架放入电泳槽中，标有正号的一端应放在正极槽内，负号的一端放在负极槽内，并把滤纸条拉紧，使其成为平面，避免中间下垂。
盖上玻璃盖，关闭电泳槽中间活塞，检查好线路。然后打开电源开关，调整电压到250V左右，并观察或测量其电流数值，记下通电时间。
为了计算迁移率，要用万用电表测量滤纸的有效长度两端的实际电压，记下读数。
（5）烘干 通电0.5h后，关闭电源开关，在滤纸与溶液交界处作上记号（以便测量长度L），然后将滤纸条由滤纸架上取下，分别平插在具有两排细针的木架上（图1-10）放入105℃烘箱中烘干15min；或吹干。
图1-10 滤纸示意图
（6）染色 用喷雾器对滤纸均匀喷洒显色剂。
（7）吹干至出现斑点。
五、结果与讨论
绘出结果图，指出各斑点的氨基酸酸碱性质并说明你判断的依据。
六、注意事项
在纸电泳中，由于滤纸常含有一定量的氨基而带负电荷，使其与纸相接触的水溶液带正电荷，使液体向负极移动。此时，粒子实际电泳的速度是粒子本身电泳速度与由于水溶液移动而产生电渗速度的迭加。因此，若粒子原来向负极移动，则表面速度将比电泳速度快；若原来向正极移动，则表面速度将比电泳速度慢。所以，中性物质有时在电场中也可能向负极移动。
思考题
纸电泳分离物氨基酸的原理是什么？
参考文献
[1]王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学[M].北京：高等教育出版社，2002.
[2]李巧枝，程绎南．生物化学实验技术[M].北京：中国轻工业出版社，2010.
内容三 DNS-Cl法测定N末端氨基酸
用于N末端分析的方法很多，下面介绍几种最常用的方法。
1.二硝基氟苯（DNFB）法
多肽或蛋白质的游离末端-NH2与DNFB（称Sanger试剂）反应后，生成二硝基苯酚（DNP）—多肽或DNP—蛋白质。由于DNFB与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定，因此DNP—多肽经酸水解后，只有N末端氨基酸为黄色DNP—氨基酸衍生物，其余的都是游离氨基酸。只要鉴别所生成的DNP—氨基酸，便可得知多肽链的N末端残基。虽然多肽侧链上的ε-NH2、酚-OH等也能与DNFB反应，但生成的侧链DNP衍生物，如α-DNP赖氨酸当用有机溶剂（如乙酸乙酯）抽提时将与游离氨基酸一起留在水相，因而容易和α-DNP氨基酸区分开来。待分析的DNP—氨基酸可用纸层析、薄层层析或HPLC进行分离鉴定和定量测定。
2.丹磺酰氯（DNS）法
丹磺酰氯（dansyl chloride，DNS）是5-（二甲氨基）萘-1—磺酰氯的简称。此方法的原理与DNFB法相同。只是用DNS代替DNFB试剂。由于丹磺酰基具有强烈的荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，并且水解后的DNS—氨基酸不需要提取，可直接用纸层析或薄层层析加以鉴定。
3.苯异硫氰酸酯（PITC）法
多肽或蛋白质的末端氨基也和氨基酸的α—氨基一样能与PITC（Edman试剂）作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质，简称苯氨基硫甲酰（PTC）—多肽或蛋白质。后者在酸性有机溶剂中加热时，N末端的P TC—氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来，除去N末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的，因为P TC基的引入只使第一个键的稳定性降低。反应液中代表N末端残基的苯基海硫因（PTH）—氨基酸，经有机溶剂抽提干燥后，可用薄层层析（如硅胶薄膜或聚酰胺薄膜等）、气相色谱或高效液相色谱等进行鉴定。
4.氨肽酶法
氨肽酶（amino peptidase）是一类肽链外切酶（exopeptidase）或称作外肽酶，它们能从多肽链的N末端逐个地向里切。根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的N末端残基序列。实际上，此法用于测定N末端和末端残基序列有许多困难，因为酶对各种肽键敏感性不一样，常常难以判断哪个残基在前，哪个残基在后。
由于荧光试剂二甲氨基茶磺酰氯（dansyl-Cl，DNS-Cl）方法测定N末端氨基酸相对其他方法具有灵敏度高，操作简单，实验中所得的DNS—氨基酸更稳定，且耐酸水解等优点。所以本实验采用DNS-Cl法测定N末端氨基酸。
一、实验目的
（1）掌握DNS-Cl法测定N末端氨基酸的原理和方法。
（2）掌握用聚酰胺薄膜分析和鉴定DNS—氨基酸的方法。
二、实验原理
DNS-Cl在碱性条件下与氨基酸（肽或蛋白质）的氨基结合成带有荧光的DNS—氨基酸（DNS—肽或DNS—蛋白质）DNS—肽和DNS—蛋白质再经酸水解可释放出DNS—氨基酸，其反应式如图1-11所示。
DNS-Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中，赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10-10～10-9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB法高100倍。将P ITC法和DNS法结合起来（称为P ITC-DNS法）应用于蛋白质结构的序列分析工作，可以提高P ITC法的灵敏度及其分析速度。DNS—氨基酸衍生物在6mol/L盐酸中105℃水解22h，除DNS—色氨酸全部被破坏，DNS—脯氨酸（77%）、丝氨酸（35%）、甘氨酸（18%）、丙氨酸（7%）部分被破坏外，其余DNS—氨基酸很少被破坏。故DNS法可用于蛋白质和肽的氨基酸组成和N末端分析。
DNS-Cl与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、ε—氨基和酚羟基反应，前两者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时完全破坏；DNS-ε—赖氨酸和DNS-O—酪氨酸较稳定，同时还有DNS—双—赖氨酸和DNS—双—酪氨酸生成，展层后在层析图谱的位点上，都与DNS-α—氨基酸有区别。
图1-11 DNS-Cl反应
DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH（图1-12）。
图1-12 DNS-Cl水解反应
在DNS-Cl过量时，会产生DNS-NH2。DNS—氨基酸在紫外光照射下呈现黄色荧光，而DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光，可彼此区分开（图1-13）。
DNS—氨基酸在酸性条件下（pH 2～3）一般都可被乙酸乙酯抽提，然后取乙酸乙酯层点样层析，这样大量DNS-Cl的反应副产物DNS-OH可留于水相，干扰因素减少，所得层析图谱清晰。但若是DNS—精氨酸、DNS—天冬氨酸、DNS—谷氨酸、DNS—苏氨酸、DNS—丝氨酸，则它们大部分或部分留于水相，往往会被遗漏，而导致得出错误结论。这时可将样品浓缩干，用甲醇直接溶解后点样，由于上述DNS—氨基酸的层析位置都位于DNS-OH的右侧，影响不大，这一点在测定多肽或蛋白质的N末端时要特别注意。
DNS—氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0.01μg（相当于10-10mol）。聚酰胺薄膜层析是1966年后发展起来的一种新层析技术。由于它具有灵敏度高、分辨率强、快速、操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析。在用于分析测定氨基酸衍生物方面超过了过去使用的纸层析、纸电泳、硅胶薄板层析等方法。
图1-13 DNS-Cl过量反应
聚酰胺（polyamide）是一类称为锦纶或尼龙的化学纤维原料，此类高分子物质含有大量的酰胺基团，故统称为聚酰胺。酰胺基团能同酚类、酸类、醌类以及硝基化合物等极性物质形成氢键。聚酰胺对被分离物质吸附能力的大小取决于二者之间氢键的强弱。在层析中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。选择适当的展层溶剂，可使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数有较大差异，经过吸附与解吸附的展层过程，就会形成一个分离顺序，达到离析的目的。聚酰胺固定于涤纶片基或其他载片上而形成一种质地均匀紧密的多孔薄膜结构即聚酰胺薄膜。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
猪胰岛素。
2.仪器
（1）聚酰胺薄膜 可以反复使用，层析后用丙酮和25%～28%浓氨水（9∶1，体积比），或用丙酮和90%甲酸（9∶1，体积比）浸泡6h。把污物洗去，再用甲醇洗涤，晾干后使用。
（2）小干燥器或小钟罩、真空干燥器、具塞磨口试管（5mL）及指形样品管、毛细管、水解管、烘箱、紫外灯、细长滴管。
3.试剂
（1）6mol/L盐酸溶液。
（2）0.2mol/L碳酸氢钠水溶液。
（3）DNS-Cl溶液 取25mg DNS-Cl溶于10mL，丙酮中。
（4）溶剂系统a甲酸（85%～90%）∶水=1.5∶100（体积比）。
（5）溶剂系统b苯∶乙酸=9∶1（体积比）。
（6）标准Gly（2.3mg/mL）和标准Phe（4.6mg/mL），均用0.2mol/L碳酸氢钠缓冲液配制。
四、实验步骤
（1）标准DNS—氨基酸的制备 称取0.2～0.3mg标准氨基酸溶于0.5mL，0.2mol/L碳酸氢钠溶液中，取0.1mL加入细长的小试管中，加入0.1mL DNS-Cl丙酮溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液调其pH达9.5～10.5，用胶布封住试管口，室温（20～25℃）放置3～4h。反应毕，用电吹风热风吹除丙酮，用1mol/ L的盐酸溶液调其pH至2.0～3.0，加入乙酸乙酯，摇匀，静止分层后，在上层的乙酸乙酯溶液中含有标准DNS—氨基酸。对于测定胰岛素的N末端氨基酸，可制备DNS-Gly及DNS-P he。
（2）DNS—胰岛素的制备及水解 取30μL胰岛素溶液置水解管中，加入30μL DNS-Cl丙酮溶液，用封口膜封口，37℃保温1h。反应完毕后，用水泵抽气抽去丙酮，加入100μL 6mol/L盐酸，使盐酸的终浓度为6mol/L。水解管在抽真空情况下，用煤气灯封口，置110℃恒温箱保温16～18h。开管，将水解管置于沸水浴上用水泵抽气抽去盐酸，直至盐酸完全挥发干净。再加2～3滴蒸馏水溶解，水浴蒸干，重复2次，以除尽盐酸。最后加1～2滴乙酸乙酯，溶解样品。
（3）DNS—氨基酸的聚酰胺薄膜层析
①聚酰胺薄膜的选择：7cm×7cm，质地均匀的薄膜。
②点样：用一端平齐的毛细管取样点在左下角距两边各为1cm处，样点直径不超过2mm，若需多次点样，需在第一次样品吹干后再点第二次。用铅笔或在薄膜的水平方向作展层第Ⅰ相的记号Ⅰ，再在垂直方向作展层第Ⅱ相的记号Ⅱ。
③展层：准备几个小密闭容器，如干燥器，再准备几个小培养皿，放入各个密闭容器中，调成水平。向每个小培养皿中各倒入约6mL的展层溶剂，使溶剂的高度不超过3mm。将容器密闭，使溶剂蒸汽在容器内达到饱和。
将点好样的聚酰胺薄膜Ⅰ方向朝上，光面朝外，聚酰胺面向内，箍一个尼龙条圈或照相底片圈（用1mol/L氢氧化钠溶液煮过），垂直放入盛有溶剂系统a的小培养皿内，盖上容器盖子，此时溶剂沿薄膜上移，进行层析。待溶剂前沿距顶端约0.5cm时，取出薄膜，用电吹风充分吹干。然后将薄膜改换成Ⅱ的方向向上，在溶剂系统b中进行第Ⅱ相层析。
本实验每人可以做3张聚酰胺薄膜的双相层析。
第一张：胰岛素DNS化样品。
第二张：标准DNS-Gly和DNS-P he样品。
第三张：胰岛素DNS化样品加上标准P he和DNS-Gly化样品。即在胰岛素DNS化样品点样后，吹干，在此位置上，重叠点上P he和DNS-Gly化样品。
五、结果与讨论
将吹干后的薄膜置于254nm或256nm的紫外线灯下观察，用铅笔圈出DNS化氨基酸所显示的荧光斑点，对上面3张图谱进行对比，确定出胰岛素的N末端氨基酸。
六、注意事项
（1）样品水解必须完全。水解后，样品管中的盐酸必须尽可能除尽，否则将影响点样及层析。
（2）点样用毛细管，管口要磨平，以避免点样时损坏薄膜。点样斑点直径以1～2mm为宜，点样后用冷风吹干，再继续点样，直至点样量满足要求。即在紫外线（UV）灯下，可见明显黄色荧光斑点。
（3）溶剂系统b层析前，务必将薄膜充分吹干，否则在Ⅱ相层析时溶剂不能上行，分离效果不好。
（4）层析所用器材必须干燥，溶剂系统配制要正确。
（5）第Ⅰ相层析后，可在UV灯下检查分离效果，但动作要快，避免生成DNS—磺酸式副产物。
思考题
1.DNS-Cl法测定N末端氨基酸具有哪些优点？
2.DNS-Cl法则定N末端氨基酸时可能出现哪些副反应？
3.DNS-Cl法测定N末端氨基酸需注意哪些事项？
参考文献
[1]滕利荣，孟庆繁．生物学基础实验教程[M].3版．北京：科学出版社，2008.
[2]陈钧辉，李俊．生物化学实验[M].3版．北京：科学出版社，2003.
内容四 甲醛滴定法测定氨基酸含量
一、实验目的
掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。
二、实验原理
氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：
H3N+—R—COO-⇔ H2N—R—COO-+H+
—
是弱酸，完全解离时pH为11～12或更高，若用碱滴定—
所释放的H+来测量氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准确指示终点。
常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使—NH—+3释放H+，使溶液的酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内（pH 9.0左右）。因此，可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。
如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量（脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定毫升数偏低。酪氨酸的滴定毫升数偏高）。如样品是多种氨基酸的混合物，如蛋白质水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度。随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表示水解作用已完全。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
甘氨酸。
2.仪器
25mL锥形瓶、3mL微量滴定管、吸管。
3.试剂
（1）0.1mol/L标准甘氨酸溶液300mL准确称取750mg甘氨酸，溶解后定容至100mL。
（2）0.1mo1/L标准氢氧化钠溶液500mL（标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。不可使用隔日贮存在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。）
（3）酚酞指示剂20mL。
（4）0.5%酚酞的50%乙醇溶液100mL。
（5）中性甲醛溶液400mL在50mL 36%～37%分析纯甲醛溶液中加入1mL 0.1%酚酞乙醇水溶液，用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定到微红，贮存于密闭的玻璃瓶中。此试剂在临用前配制。如已放置一段时间，则使用前需重新中和。
四、实验步骤
（1）取3个25mL的锥形瓶，编号。向1、2号瓶内各加入2mL，0.1mo1/L的标准甘氨酸溶液和5mL水，混匀。向3号瓶内加入7mL水。然后向3个瓶中各加入5滴酚酞指示剂，混匀后各加2mL甲醛溶液，再混匀，分别用0.1mo1/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。
重复以上实验两次，记录每次每瓶消耗标准氢氧化钠溶液的体积（mL）。取平均值，计算甘氨酸氨基氮的回收率，如式（1-7）所示。
式（1-7）中实际测得量为滴定1、2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液体积（mL）的平均值与3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液体积（mL）之差乘以标准氢氧化钠的物质的量浓度，再乘以14.008。2mL乘以标准甘氨酸的物质的量浓度再乘以14.008，即为加入理论量的毫克数。
（2）取未知浓度的甘氨酸溶液2mL，依上述方法进行测定，平行做几份，取平均值。计算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克数，如式（1-8）所示。
式中 A——滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均体积，mL；
B——滴定对照液（3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均体积，mL；
cNaOH——标准氢氧化钠溶液的真实物质的量浓度，mol/L。
五、结果与讨论
记录实验结果。
六、注意事项
利用甲醛滴淀法可以用来测定蛋白质的水解程度。随着蛋白质水解度的增加，滴定值也增加，当蛋白质水解完成后，滴定值不再增加。
思考题
选用酚酞指示剂，为什么滴定的是氨基？
参考文献
[1]魏群．基础生物化学实验[M].3版．北京：高等教育出版社，2009.
[2]滕利荣，孟庆繁．生物学基础实验教程[M].3版．北京：科学出版社，2008.
[3]陈钧辉，陶力，李俊，等．生物化学实验[M].3版．北京：科学出版社，2003.
实验六 凝胶过滤层析测定蛋白质的分子质量（Mr）
一、实验目的
（1）了解凝胶过滤层析的原理及其应用。
（2）通过测定蛋白质分子质量的训练，初步掌握凝胶层析技术。
二、实验原理
凝胶层析又称排阻层析、凝胶过滤、渗透层析或分子筛层析等。它广泛应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质的分子质量也是它的重要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排阻效应实现的，亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越长，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，从而达到分离的目的。
对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0～100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，如式（1-9）所示。
在限定的层析条件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是随着分离物分子质量的变化而改变。分子质量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子质量小，Ve值大，Kav值大。
有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子质量的一个依据。在相同层析条件下，被分离物质Kav值差异越大，分离效果越好。反之，分离效果差或根本不能分开。在实际的实验中，我们可以实测出Vt、V0及Ve的值，从而计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，Kav与lgMw（Mw表示物质的分子质量）成线性关系，如式（1-10）和式（1-11）所示。
式中 b，C——常数。
同样可以得到：
式中 b′，C′——常数。
即，Ve与lgMw也成线性关系。我们可以通过在一凝胶柱上分离多种已知分子质量的蛋白质后，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后用同一凝胶柱测出其他未知蛋白质的分子质量。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
蛋白质样品。
2.仪器
玻璃层析柱（20mm×60cm），恒流泵（或下口恒压贮液瓶），自动部分收集器，紫外分光光度计，100mL试剂瓶，1000mL量筒，50、100、250mL烧杯，10mL（或5mL）刻度试管。
3.试剂
（1）标准蛋白质
牛血清白蛋白：Mw=67000（上海生化所）。
鸡卵清清蛋白：Mw=45000（美国SIGMA公司）。
胰凝乳蛋白酶原A：Mw=24000（美国SIGMA公司）。
溶菌酶：Mw=14300。
（2）0.025mol/L KCl-0.1mol/L HAc（乙酸）洗脱液1000mL。
（3）蓝色葡聚糖-2000
四、实验步骤
（1）凝胶的溶胀 称取7g Sephadex G-75于250mL烧杯中加入洗脱液100mL，沸水浴溶胀4～6h（可去除颗粒内部的空气及灭菌），反复倾泻去掉细颗粒，然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气。
（2）装柱
①取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。
②凝胶柱总体积（Vt）的测定 在距柱上端约5cm处作一记号，关闭柱出水口，加入去离子水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接收柱中去离子水（水面降至层析柱玻璃筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt，也可以最后走完未知蛋白质后再测定Vt。
③在柱中注入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆液缓慢倾入柱中，待凝胶沉积1～2cm高度后打开出水口，流速一般用3～6mL/10min。胶面上升到柱记号处则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口，静置片刻，等凝胶完全沉降，则接上恒流泵，用1～2倍床体积的洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。
（3）V0的测定 吸去柱上端的洗脱液（切不要搅乱胶面，可盖一张滤纸或尼龙网）。打开出水口，使残余液体降至与胶面相切（不要干），关闭出水口。用细滴管吸取0.5mL（2mg/mL）蓝色葡聚糖-2000，小心地绕柱壁一圈（距胶面2mm）缓慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，打开出水口开始收集，等溶液渗入胶床后，关闭出水口，用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后用3mL/10min的速度开始洗脱。最后做出洗脱曲线。收集并量出从加样开始至洗脱液中蓝色葡聚糖浓度最高点的洗脱液体积，即为V0[注意：蓝色葡聚糖洗下来之后，还要用洗脱液（1～2倍床体积）继续平衡一段时间，以备下步实验使用]。
（4）标准曲线的制作
①用洗脱液配制标准蛋白质溶液，溶液中四种蛋白质的浓度各为牛血清白蛋白（2.5mg/mL）、鸡卵清清蛋白（6.0mg/mL）、胰凝乳蛋白酶原A（2.5mg/mL）和溶菌酶（2.5mg/mL）。
②按（3）的操作方法加入上述标准蛋白质溶液（0.5～1mL），以1.5mL/5min的速度洗脱并收集洗脱液。
③用紫外分光光度计逐管测定A280，并确定各种蛋白质的洗脱峰最高点，然后量出各种蛋白质的洗脱体积Ve。由于每管只收集了1.5mL洗脱液，量比较少，因此比色时要加入一定量的洗脱液进行测定（一般的比色杯可装3mL溶液）。当然，也可以用微量比色杯进行测定。
④以A280为纵坐标，Ve为横坐标画出标准蛋白质的洗脱曲线。
⑤以Kav为纵坐标，lgMw为横坐标作图画出一条标准曲线。
⑥以Ve为纵坐标，lgMw为横坐标作图画出一条标准曲线。
五、结果与讨论
未知蛋白质分子质量的测定：测定方法同标准曲线制作的①②③步相同，然后在标准曲线上查得lgMw，其反对数便是待测蛋白质的分子质量。实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，严禁将凝胶丢弃或倒入水池中。
六、注意事项
（1）根据层析柱的容积和所选用的凝胶溶胀后柱床容积，计算所需凝胶干粉的质量，以将用作洗脱剂的溶液使其充分溶胀。
（2）层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据试剂需要选择。一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心部分的组分移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。
对于脱盐的柱一般都是短而粗的，柱长（L）/直径（D）＜10；对分级分离用的柱，L/D值可以比较大，对很难分离的组分可以达到L/D=100，一般选用内径为1cm，柱长100cm就够了。
（3）装柱要均匀，不要过松也不要过紧，最好也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。但也不要过慢，使柱装得太松，导致在层析过程中，凝胶床高度下降。
（4）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。
（5）用此方法测蛋白质的相对分子质量，受蛋白质形状的影响，并且测得的结果可能是聚合体的相对分子质量，因而还需用电泳等方法进一步验证相对分子质量测定结果。
思考题
1.某样品中含有1mg A蛋白质（Mr 10000u），1mg B蛋白质（Mr 30000u），4mg C蛋白质（Mr 60000u），1mg D蛋白质（Mr 90000u），1mg E蛋白质（Mr 120000u），采用Sephadex G75（排阻上下限为2000～70000u）凝胶柱层析，请指出各蛋白质的洗脱顺序。
2.利用凝胶层析法分离混合样品时，怎样才能得到较好的分离效果？
3.怎样计算各种蛋白质的相对含量？
参考文献
[1]王秀奇，秦淑媛，高天慧，等．基础生物化学实验[M].2版．北京：高等教育出版社，1999.
[2]陈钧辉，陶力，李俊，等．生物化学实验[M].3版．北京：科学出版社，2003.
实验七 氨基移换反应的定性实验
一、实验目的
（1）学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及其原理；
（2）进一步掌握纸层析的原理和操作技术；
（3）了解氨基移换作用在中间代谢中的意义。
二、实验原理
本实验利用纸上层析法，检查由谷氨酸和丙酮酸在谷丙转氨酶的作用下所生成的丙氨酸，证明组织内氨基移换作用。为了防止丙酮酸被组织中其他酶所氧化或还原，可加碘乙酸或溴乙酸抑制酵解作用或氧化作用。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
家兔。
2.仪器
解剖刀、剪刀、镊子、解剖盘、表面皿、匀浆器、台秤、离心机、试管及试管架、恒温水浴、毛细玻璃管、直尺、铅笔、层析滤纸、电热鼓风干燥箱、培养皿、层析缸、小烧杯、钉书器、喷雾器。
3.试剂
（1）0.067mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）、1%谷氨酸溶液（用氢氧化钾中和至中性）、1%丙酮酸溶液（用氢氧化钾中和至中性）、0.1%碳酸氢钾溶液0.05%碘乙酸溶液、15%三氯乙酸溶液、标准丙氨酸溶液（0.1%）、标准谷氨酸溶液（0.1%）、0.1%水合茚三酮乙醇溶液。
（2）酚溶剂 在大烧杯中，加蒸馏水40mL，再加入新蒸馏的无色苯酚150g在水浴中加热搅拌，混合至苯酚完全溶解。将该溶液倒入盛有100mL蒸馏水的500mL分液漏斗内，轻轻振荡混合，使其成为乳状液。静置7～10h，乳状液变成两层透明的溶液，下层为被水饱和的酚溶液（即酚溶剂），放出下层，贮存在棕色试剂瓶中备用。
四、实验步骤
（1）酶液的制备 将兔击晕，迅速解剖，取出肝脏，在低温条件下剪碎。用表面皿称取1.5g肝脏，放入匀浆器中，再加入3mL，磷酸缓冲液。研成匀浆后，倒入离心管中，在2500r/min的条件下，离心5min，取上清液，即为制备的酶液。
（2）体外氨基移换反应 取2支试管，编号。向1号管中加入15%三氯乙酸溶液10滴和酶液10滴，混匀，静置15min，作对照管。向2号管中加入酶液10滴，然后向1、2号管中各加入1%谷氨酸溶液10滴、1%丙酮酸溶液10滴、0.1%碳酸氢钾溶液10滴和0.05%碘乙酸溶液5滴，混匀，放入37～40℃恒温水浴中保温1.5～2h。在保温过程中，将试管摇荡几次。保温完毕后取出试管，立即向2号管中加入15%三氯乙酸溶液10滴以沉淀蛋白质，终止酶促反应。将2支试管的内容物分别离心，2500r/min，5min。将上清液转移到试管中，用塞子塞紧，放置于低温处备用。
（3）纸上层析法检查 两人合用一张滤纸（宽15cm，长20cm），如图1-14所示，在其一端距边缘1.5cm处，用铅笔轻画一条与纸边平行的直线作为层析基线，在基线上每隔2cm用铅笔点一小点，共9点。点样时，将毛细管口轻轻触到滤纸上，使每种溶液分别形成直径为2～3mm的圆斑。为了有足够量的样品点在滤纸上，每种溶液应重复点3～4次。每次点样后，待自然风干（或用吹风机吹干），再点下一次，点样量应力求均匀相等。每人4个点和标准丙氨酸1个点。点样后，将滤纸卷成圆筒，用订书机将两端缝合，并留一宽缝，以免接触产生毛细现象。钉好后放入层析罩内，层析装置，如图1-14所示。
图1-14 纸层析示意图
1—层析罩上口磨口塞 2—层析滤纸 3—层析罩 4—平衡溶剂 5—层析缸 6—培养皿
用被酚所饱和的水溶液，平衡20min后，用带小漏斗的玻璃管从层析罩上加饱和酚试剂25mL于层析缸内。然后，立即盖紧塞子，当溶剂前沿达到距滤纸上端约2.5cm处，取出滤纸，晾干。按前述方法显色。
五、结果与讨论
解释得到的层析图谱，计算各种氨基酸的Rf值。
六、注意事项
（1）点样时要避免手指或唾液等污染滤纸。
（2）点样斑点不能太大，直径应小于0.3cm，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠。
（3）展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。
思考题
1.什么叫氨基移换（或转氨基）作用？试说明该作用的特点及其在中间代谢中的意义。
2.回顾所做过的生物化学实验，你对于了解生物体组织代谢实验的特点有什么认识和体会？
3.氨基移换反应的定性实验需注意的事项有哪些？
参考文献
滕利荣，孟庆繁．生物学基础实验教程[M].3版．北京：科学出版社，2009.
实验八 植物色素分离-—薄层层析法
一、实验目的
学习薄层层析的基本原理及操作方法。掌握用硅胶G分离油脂中色素。
二、实验原理
硅胶对色素有一定的吸附，色素在混合溶剂（展层剂）中的分配系数不同，当展层剂通过油脂原点冰向前流动时，各色素由于吸附与解吸附速度差异和连续分配而被分开。
用标准色素定位可鉴定色素种类。
把色素斑点刮下溶解定容，可测定样品中色素含量。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
植物色素。
2.仪器
玻璃板（4cm×15cm）、涂布器、毛细管、吹风机、烘箱、天平。
3.试剂
（1）硅胶G。
（2）展层剂（石油醚∶乙醚=92∶8）。
（3）植物色素 胡萝卜素（橙黄色）、叶黄素（黄色）、叶绿素a（蓝绿色）、叶绿素b（黄绿素）。
四、实验方法
（1）硅胶预处理（购买已处理过的硅胶）500g硅胶与1000mL HCl（1∶1）一同浸泡数天，倾去上层清液，固体物用倾泻法水洗3次，最后抽滤，在漏斗上水洗至中性。再用300mL干燥的苯洗涤，在120℃干燥。
（2）铺板 用水将硅胶（硅胶∶水=1∶2～3，稍微静置，用玻璃棒推平）在烧杯中调成糊状，立即倒入干净的玻璃板上，用涂布器涂层（后0.25～1mm；玻棒涂布器沾水，朝一个方向），一定要平，120℃干燥（约15min）。
（3）点样 在玻板一端2cm处用毛细管轻点1滴样品。
（4）展层 取烧杯倒入1cm深的展层剂，把玻板样点朝下、薄层朝上倾斜插入烧杯（加盖）。当溶剂前沿至顶端1cm时，取出。
（5）显色 热风烘干，观察。
（6）定量 略。
五、结果与讨论
移动由快到慢顺序为胡萝卜素（橙黄色）、叶黄素（黄色）、叶绿素a（蓝绿色）、叶绿素b（黄绿素）。
六、注意事项
薄层层析的Rf值受多种因素影响，即使严格按照实验要求做了，结果的重现性仍较差。因此，薄层定性时常与标准品一起点样进行对比分析。
思考题
1.薄层板的涂布要求是什么？为什么要这样做？
2.点样的要求是什么？为什么要这样做？
3.展开前层析缸内空间为什么要用溶剂蒸汽预先进行饱和？
4.在一定的操作条件下为什么可利用Rf值来鉴定化合物？
5.在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位置？
6.展开剂的高度若超过了点样线，对薄层色谱有何影响？
参考文献
[1]王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学[M].北京：高等教育出版社，2002.
[2]李巧枝，程绎南．生物化学实验技术[M].北京：中国轻工业出版社，2010.
实验九 卵磷脂的提取和鉴定
一、实验目的
掌握用乙醇作为溶剂提取卵磷脂的原理和方法。
二、实验原理
卵磷脂在脑、神经组织、肝、肾上腺和红细胞中含量较多，蛋黄中含量特别多。卵磷脂易溶于乙醇、乙醚等脂溶剂，可利用此溶剂提取。
新提取的卵磷脂为白色蜡状物，与空气接触后因所含不饱和脂肪酸被氧化而成黄褐色，卵磷脂中的胆碱基在碱性溶液中可分解成三甲胺，具有特殊的鱼腥味，可鉴别。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
鸡蛋黄。
2.仪器
烧杯、漏斗、蒸发皿、水浴锅、试管、量筒。
3.试剂
（1）95%乙醇。
（2）10%氢氧化钠溶液。
（3）丙酮。
四、实验步骤
（1）提取 于小烧杯内置蛋黄2g，加入热95%乙醇15mL，边加边搅，冷却，过滤，如滤液混浊，需重滤直到其完全透明。将滤液置蒸发皿内，于蒸汽浴上蒸干，残留物即卵磷脂。
（2）鉴定 取提取的卵磷脂少许，置试管内加10%氢氧化钠溶液2mL，水浴加热，是否产生鱼腥味。另取一些卵磷脂溶于1mL乙醇中，添加1～2mL丙酮，观察变化。
五、结果与讨论
卵磷脂收率以式（1-12）计算。
六、注意事项
注意安全：本实验中的丙酮、乙醇均为易燃药品。
思考题
1.卵磷脂的主要生理功能有哪些？
2.卵磷脂提取过程中加入热95%的乙醇的作用是什么？
3.卵磷脂在食品工业的应用有哪些？
参考文献
[1]魏群．基础生物化学实验[M].3版．北京：高等教育出版社，2009.
[2]滕利荣，孟庆繁．生物学基础实验教程[M].3版．北京：科学出版社，2008.
[3]陈钧辉，陶力，李俊，等．生物化学实验[M].3版．北京：科学出版社，2003.