四、生物大分子制备技术
生命大分子物质通常是指动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所产生的蛋白质（包括酶）和核酸等有机化合物的总称。生命科学研究将进入后基因组时代，主要的研究方向就是以核酸和蛋白质的结构与功能为基础，从分子水平去认识生命现象。因此，得到高纯度具有生物活性的目的物质成为一切研究的首位。生物大分子的制备工作涉及物理、化学、生物等多学科知识，其制备的一般过程包括生物材料的前处理、生物大分子的粗分离、生物大分子的纯化、浓缩和干燥、生物大分子的鉴定等步骤。
（一）生物材料的前处理
1.生物材料的选择
（1）微生物材料 ①利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶；②利用微生物菌体含有的生化物质：蛋白质、核酸和胞内酶等。使用微生物作为提取材料时要注意它的生长期。因为，在它达到对数生长期时，酶和核酸的含量较高，可获得较高的产量。
（2）植物材料 利用材料的根、茎、叶、果实等部分提取其中的生物活性物质。使用植物作为提取材料时要注意它的品种、生长地域、季节、气候条件等，甚至采摘的时间段都要考虑。
（3）动物材料 利用动物的脏器或组织提取有效成分。主要是选择有效成分含量丰富的部分。动物材料一般要进行绞碎、脱脂等处理。
上述处理后的材料，若不立即进行试验应冷冻保存。而对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
2.细胞的破碎
除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶以外，对于细胞内或多细胞生物组织中的各种生物大分子的分离纯化，都需要事先将细胞和组织破碎，使生物大分子充分释放到溶液中，并不丢失生物活性。不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。
3.生物大分子的提取
提取是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态、不丢失生物活性的过程。这一过程是将目的产物与细胞中其他化合物和生物大分子分离，即由固相转入液相，或从细胞内的生理状况转入外界特定的溶液中。影响提取的因素主要有：目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；由固相扩散到液相的难易；溶剂的pH和提取时间等。一种物质在某一溶剂中溶解度的大小与该物质的分子结构及使用的溶剂的理化性质有关。一般地说，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；温度升高，溶解度加大，远离等电点的pH，溶解度增加。提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。
（二）生物大分子的粗分离
分离纯化的方法很多，主要有：根据溶解度不同；根据分子大小差别等。
1.根据溶解度不同的分离方法
（1）盐析 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为盐析。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。20%～40%饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43%饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清。盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，其突出的优点是：①成本低，不需要特别昂贵的设备；②操作简单、安全；③对许多生物活性物质具有稳定作用。
（2）等电点沉淀法 等电点沉淀法是利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。但是，由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或与其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白。
（3）有机溶剂沉淀法 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其沉淀作用的原理主要是降低水溶液的介电常数。溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大，如20℃时水的介电常数为80，而乙醇和丙酮的介电常数分别为24和21.4，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。另一方面，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。
2.根据生物大分子大小差别的分离方法
（1）透析与超滤 透析法是利用半透膜将大小不同的生物大分子分开。超滤法是利用高压力或离心力，使水和其他小的溶质分子通过半透膜而生物大分子留在膜上。选择不同孔径的滤膜截留不同相对分子质量的生物大分子。
（2）凝胶过滤法（分子排阻层析法或分子筛层析）这是根据分子大小分离蛋白质混合物的有效方法之一。主要填充材料是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶。
（三）生物大分子的纯化
进一步将粗提物中其他的化合物和生物大分子除去的步骤称为纯化。纯化的步骤与纯化程度要求有密切关系，如要达到结晶纯度（99%以上），则一种纯化方法不易达到，可能要用多种方法步骤。主要有根据蛋白质带电性质进行分离、根据生物大分子的带电情况分离和根据蛋白质配体的特异性差异分离等。
（1）电泳法 电泳是最好的纯化方法之一，可以获得高纯的产品，但由于制备量有限，故只能作微量的纯化技术。
（2）离子交换层析法 阳离子交换剂：羟甲基纤维素；阴离子交换剂：二乙氨基乙基纤维素。
（3）亲和层析法 亲和层析法是分离蛋白质的一种非常有效的方法。它通常需要一步处理即可使某种待提纯分离的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。
（四）生物大分子的浓缩与干燥
1.样品浓缩
纯化后的样品往往液体体积较大，样品含量浓度低，需把体积减小以提高样品浓度，这就是浓缩过程。
（1）减压加温蒸发浓缩 通过降低液面压力使液体沸点降低。减压的真空度越高液体沸点越低，蒸发越快。此法适合不耐热的生物大分子浓缩。
（2）空气流动蒸发浓缩 空气流动可使液体加速蒸发。将铺成薄膜的液体表面不断通过空气流，或将样品溶液装入透析袋，置于冷室，用电扇对准吹风，使透析膜外溶剂不断蒸发达到浓缩目的。此法浓缩速度慢，不适于大量溶液处理。
（3）冰冻法 生物大分子溶液在低温下结成冰，盐类和生物大分子不能进入冰内而留在未结冰的液相中。操作时，先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢融解，利用溶剂与溶质融解点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如：蛋白质或酶的盐溶液浓缩。
（4）吸收法 通过吸收剂直接吸收除去溶剂分子使之浓缩。此法要求吸收剂与溶剂不起化学反应，对生物大分子不吸附，并且吸收剂与溶液易分开。常用的吸收剂有：聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、蔗糖和凝胶等。
（5）超滤法 使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性的过滤。当溶液在一定压力下（氮气加压或真空负压）通过膜，溶剂和小分子透过而大分子受阻保留。此法是近年发展的新方法，应用较广，对蛋白质和酶溶液的浓缩、脱盐具有成本低、操作方便、条件温和、较好的保持生物大分子活性及回收率高等优点。
2.干燥
（1）真空干燥 适用于不耐高温、易于氧化物质的干燥和保存。装置包括：干燥器、冷凝器和真空泵。干燥剂常用：P2O5、CaCl2（无水）、变色硅胶等。
（2）冷冻干燥 除利用真空原理外，还增加温度因素。此法是在低温低压下使冰升华变成气体而除去。产品具有疏松、溶解度好和保持天然结构等优点。
（五）生物大分子的鉴定
目的生物大分子物质经过粗提、纯化、浓缩、干燥等一系列的操作，获得的样品必须经过鉴定，以确定制得的样品在数量上和质量上是否达到预期的目的。实际上，鉴定步骤不仅在分离制备的最终阶段，有些样品是贯穿在分离制备的每一个阶段。如果不是在每一步都对样品进行鉴定，最后的产品发现有问题，就难以确定是制备过程中的哪一步出了问题。对每一步进行鉴定，可以尽早发现问题并纠正，保证最终产品的质量。当然中间步骤产品的鉴定，不用像最终产品鉴定一样全面，只需进行1～2项特殊性的检查即可。如制备酶时，只需每步检查是否具有酶活即可。