任务1 普通光学显微镜的使用及维护

学习要求

1.复习普通光学显微镜的结构、各部分功能及使用方法。

2.学习并掌握油镜的原理及使用方法。

知识准备

一、显微镜与显微技术

绝大多数微生物的大小都远远小于肉眼的观察极限，因此，一般必须借助显微镜的放大系统的作用才能看清它们的个体形态和内部结构。除了放大外，决定显微镜观察效果的因素还有两个，即分辨率和反差。分辨率是能辨别两点间最小距离的能力，而反差指样品区别于背景的程度，它们与显微镜自身的特点有关，但也取决于对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这就是显微技术。而现在的显微技术，不仅仅是观察物体的形态、结构，而且发展到对物体组成成分的定性与定量，特别是与计算机技术的结合出现的图像分析、模拟仿真技术等，为探索微生物的奥秘增添了强大的武器。

1.显微镜的种类

显微镜可分为电子显微镜和光学显微镜两大类。光学显微镜包括：明视野显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜、立体显微镜等。其中明视野显微镜为最常用的普通光学显微镜，其他显微镜都是在此基础上发展而来的，基本结构相同，只是在某些部分做了一些改变。明视野显微镜简称显微镜。

（1）普通光学显微镜 这是常见而又最常用的一种显微镜。它的分辨率是0.2μm，最大放大倍数不超过2000倍。除大部分病毒外，在光学显微镜下可以看到微生物的个体。但是一般无法看清它们的内部结构。

（2）暗视野显微镜 在普通光学显微镜的基础上改良，将原来的明视野集光器，调换成一个特制的暗视野集光器，变成了暗视野显微镜。

（3）相差显微镜 相差显微镜的原理：利用广播干涉和衍射原理，使光线通过一个透明物体时，由于其中不同部位的厚度和折射指数的差异产生的相位差，变成不同亮度的强度差，增大了物体的明暗反差，这样便能观察到透明物体的活细胞和未被染色的标本。

相差显微镜常用于活体细胞或未被染色的标本的观察。

（4）紫外线显微镜 它用紫外线作为照明光源。由于紫外线的平均波长约为250nm，相当于可见光平均波长的1/2，这样，分辨率大约提高一倍。由于人们肉眼看不见这种波长较短的光线，因此所有的物相必须用摄影法摄片后才能观察。

（5）荧光显微镜 由于费用和复杂程度，紫外线显微镜的应用受到限制。可对它稍微进行改进，变为荧光显微镜，就大大增加了应用价值。

荧光显微镜在微生物免疫学上应用较为广泛。

（6）透射电子显微镜 电子显微镜的发展是20世纪应用物理学的一大成就。电子显微镜的光源不是可见光，而是波长极短的电子。在理论上，电子波的长短可达到0.005nm，所以电子显微镜的分辨率要远高于光学显微镜。理论依据是：电子束通过电磁场时会产生复杂的螺旋式运动，但最终的结果是正如光线通过玻璃透镜时一样，产生偏转、汇聚和发散，并同样可以聚集成像。几十年来，电子显微镜技术发展很快，应用也日益广泛，对包括微生物学在内的许多学科的进步都起到了巨大的推动作用。

（7）扫描电子显微镜 扫描电子显微镜（SEM）与光学显微镜和透视电子显微镜不同，它的工作原理类似于电视火电传真照片。

扫描电子显微镜主要被用于观察样品的表面结构，也可以对样品各个微曲的元素组成进行扫描。

（8）扫描隧道显微镜 在光学显微镜和电子显微镜的结构和性能得到不断完善的同时，基于其他各种原理的显微镜也不断问世，使人们认识微观世界的能力和手段不断提高。其中20世纪80年代才出现的扫描隧道显微镜是显微镜领域的新成员，主要原理是利用了量子力学中的隧道效应。分辨率可达到0.1～0.2nm，纵向分辨率达到0.001nm，是目前分辨率最高的显微镜，足以对单个原子进行观察。

2.显微观察样品的制备

样品的制备是显微技术的一个重要环节，直接影响到显微镜观察效果的好坏。一般来说，在利用显微镜观察、研究生物样品时，除要根据显微镜使用的特点采用合适的制片方法外，还应考虑生物样品的特点，尽可能地使被观察的生物样品的生理结构保持稳定，并通过各种手段提高反差。

（1）光学显微镜的制样 光学显微镜是微生物学研究的最常用工具，有活体观察和染色观察两种基本使用方法。

①活体观察：可采用压滴法、悬滴法及菌丝埋片法等在明视野、暗室野或相差显微镜下对微生物活体进行观察。其特点是可以避免一般染色制样时的固定对微生物细胞的破坏，并可用于专门研究微生物的运动能力、摄食特性及生长过程中的形态变化，如细胞分裂、芽孢萌发等动态过程。

压滴法：将悬菌液滴于载玻片上，加盖盖玻片后立即进行观察。

悬滴法：在盖玻片中央加一小滴悬菌液后反置于特制的凹载玻片上进行观察，为防止液滴蒸发变干，一般还应在盖玻片四周加封凡士林。

菌丝埋片法：将无菌小块玻璃纸铺于平板表面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，经培养，取下玻璃纸置于载玻片上，用显微镜对菌丝的形态进行观察。

②染色观察：一般微生物菌体小而无色透明，在光学显微镜下，细胞体液及结构的折光率与其影像差很小，因此用压滴法或悬滴法进行观察时，只能看到其大体形态及运动情况。若要在光学显微镜下观察其细致形态及主要结构，一般都需要对它们进行染色，从而借助颜色的反衬作用提高观察样品不同部位的反差。

染色前必须先对涂在载玻片上的样品进行固定。其目的有两个：一是杀死细菌并使菌体黏附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用酒精灯火焰加热和化学固定两种方法。固定时应尽量保持细胞原有形态，防止细胞收缩或膨胀。

（2）电子显微镜的制样 生物样品在进行电镜观察前必须进行固定和干燥，否则镜筒中的高真空会导致其严重脱水，失去样品的原有空间构型。此外，由于构成生物样品的主要元素对电子的吸收和散射能力都较弱，在制样时一般都采用重金属盐染色或喷镀，以提高电镜下的反差，形成敏感清晰的电子图像。

①透视电镜样品的制备：电子的穿透能力有限，因此透视电镜采用覆盖有支持膜的载网来承载被观察的样品。最常用的载网是铜网，也有用不锈钢、金、银、镍等其他金属材料制备的网。而支持膜可用塑料膜，也可用碳膜或金属膜。

a.负染技术：与将样品本身染色来提高反差的方法想反，负染技术使用电子密度高、本身不显结构且与样品不反应的物质来对样品进行染色。这些重金属盐不被样品成分所吸附而是沉积到样品四周，如果样品具有表面结构，这种物质还能进入表面上的凹陷部分，从而可以通过散射电子能力的差异把样品的外形和表面结构清晰地衬托出来。负染技术简便易行，病毒、细菌、离体细胞器、蛋白质和核酸等大分子等形态大小和形态结构都可以采用这种方法进行观察。

b.投影技术：在真空蒸发设备中将铂或铬等对电子散射能力较慢的金属原子，由样品的斜上方进行喷镀，提高样品的反差。

c.超薄切片技术：尽管微生物个体通常极其微小，但除病毒外，微弱的电子束仍无法透过一般微生物如细菌的整体标本，需制作成100nm以下厚度的超薄切片，方能看清其内部的细微结构。此外，从细菌、立克次氏体、螺旋体、病毒等病原体等宿主细胞的关系，对宿主细胞引起的超微形态的改变，以及如病毒对宿主细胞的吸附、进入、繁殖等机理的研究，也都需要将宿主的组织或培养细胞制成超薄切片后才能用透视电镜观察。可以说，超薄切片技术是生物学中研究细胞及组织超微结构的最常用、最重要的电镜样品制备技术，其基本操作步骤如下：取样——固定——脱水——包埋——切片——捞片——染色——观察。

②扫描电镜样品的制备：扫描电镜的结构特点是利用电子束做光栅状扫描以取样品的信息全貌。因此，其样品制备方法比透射电镜要简单，它主要要求样品干燥，并且表面能够导电。对大多数生物材料来说，细胞含有大量的水分，所以在观察前必须进行处理，去除水分，对表面喷镀金属导电层。在这过程中必须始终保持样品不变形，这样最后的观察才能反映样品本来的面目。保持样品形状的主要关键是样品干燥。干燥方法有自然干燥、真空干燥、冷冻干燥和临界点干燥等。其中临界点干燥效果最好，其原理是利用许多物质，如液态的二氧化碳，在一个密闭容器中达到一定的温度和压力后，汽液相面消失的性质，使样品在没有表面张力的条件下得到干燥，很好地保持样品的形态。干燥、喷镀金属层后样品便可用于观察。

二、普通显微镜的构造

普通光学显微镜的构造可以分为机械系统和光学系统两大部分（图2－1）。

1.机械系统

（1）镜座 在显微镜的底部，呈马蹄形、长方形、三角形等。

（2）镜臂 连接镜座和镜筒之间的部分，呈圆弧形，作为移动显微镜时的握持部分。

（3）镜筒 位于镜臂上端的空心圆筒，是光线的通道。镜筒的上端可插入接目镜，下面可与转换器相连接。镜筒的长度一般为160mm。显微镜分为直筒式和斜筒式；有单筒式的，也有双筒式的。

（4）旋转器位于镜筒下端，是一个可以旋转的圆盘。有3～4个孔，用于安装不同放大倍数的接物镜。

（5）载物台 是支持被检标本的平台，呈方形或圆形。中央有孔可透过光线，台上有用来固定标本的夹子和标本移动器。

（6）调焦旋钮 包括粗调焦钮和细调焦钮，是调节载物台或镜筒上下移动的装置。

2.光学系统

（1）接物镜 常称为镜头，简称物镜（图2－2），是显微镜中最重要的部分，由许多块透镜组成。其作用是将标本上的待检物进行放大，形成一个倒立的实像，一般显微镜有3～4个物镜，根据使用方法的差异可分为干燥系和油浸系两组。干燥系物镜包括低倍物镜（4～10×）和高倍物镜（40～45×），使用时物镜与标本之间的介质是空气；油浸系物镜（90～100×）在使用时，物镜与标本之间加有一种折射率与玻璃折射率几乎相等的油类物质（香柏油）作为介质。

（2）接目镜 通常称为目镜，一般由2～3块透镜组成。其作用将由物镜所形成的实像进一步放大，并形成虚像而映入眼帘。一般显微镜的标准目镜是10 ×。

（3）聚光镜 位于载物台的下方，由两个或几个透镜组成，其作用是将由光源来的光线聚成一个锥形光柱。聚光镜可以通过位于载物台下方的聚光镜调节旋钮进行上下调节，以求得最适光度。聚光器还附有虹彩光圈，是调节锥形光柱的角度和大小，以控制进入物镜的光的量。

（4）反光镜 反光镜是一个双面镜，一面是平面，另一面是凹面，起着把外来光线变成平行光线进入聚光镜的作用。使用内光源的显微镜就无须反光镜。

（5）光源 日光和灯光均可，以日光较好，其光色和光强都比较容易控制，有的显微镜采用装在底座内的内光源。

三、显微镜的成像原理

显微镜的放大作用是由物镜和目镜共同完成的。标本经物镜放大后，在目镜的焦平面上形成一个倒立实像，再经目镜进一步放大形成一个虚像，被人眼所观察到（图2－3）。

在油镜系中，载玻片与镜头之间多用香柏油作介质。因香柏油的折射率（n＝1.51）与玻璃的折射率（n＝1.52）几乎相等，故透过载玻片的光线通过香柏油后，直接进入物镜，而不发生折射。两组物镜光线通路的区别如图2－4所示。

四、显微镜的性能

1.分辨率和数值口径

衡量显微镜性能好坏的指标主要是显微镜的分辨率，显微镜的分辨率是指显微镜将样品上相互接近的两点清晰分辨出来的能力。它主要取决于物镜的分辨能力，物镜的分辨力是所用光的波长和物镜数值口径的函数。分辨率用镜头所能分辨出的两点间的最小距离表示，距离越小，分辨能力越好。可用式（2－1）表示：

物镜的数值口径（numberical aperture），简写为（N. A）：表示从聚光镜发出的锥形光柱照射在观察标本上，能被物镜所聚集的量。可用式（2－2）表示：

式中 n——标本和物镜之间介质的折射率

θ——由光源投射到透镜上的光线和光轴之间的最大夹角

光线投射到物镜的角度越大，数值口径就越大。如果采用一些高折射率的物质作介质，如使用油镜时采用香柏油作介质，则数值口径增大，从而提高分辨能力。物镜镜筒上标有数值口径，低倍镜为0.25，高倍镜为0.65，油浸镜为1.25。这些数值是在其他条件都适宜的情况下的最高值，实际使用时，往往低于所标的值。

2.放大倍数、焦距和工作距离

显微镜的放大倍数是物镜和目镜放大倍数的乘积。放大倍数一样时，由于目镜和物镜搭配不同，其分辨率也不同。一般来说，增加放大倍数应该是尽量用放大倍数高的物镜。物镜的放大倍数越大，焦距越短，物镜和样品之间的距离（工作距离）便越短。

五、注意事项

（1）持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手提取，以免零件脱落或碰撞到其他地方。

（2）轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，以免碰翻落地。

（3）保持显微镜的清洁，光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭，切忌口吹、手抹或用布擦，机械部分用布擦拭。

（4）水滴、酒精或其他药品切勿接触镜头和镜台，如果沾污应立即擦净。

（5）要养成两眼同时睁开的习惯，以左眼观察视野，右眼用以绘图。

（6）不要随意取下目镜，以防止尘土落入物镜，也不要任意拆卸各种零件，以防损坏。

（7）使用完毕后，必须复原才能放回镜箱内。最后填写使用登记表。

（8）调节粗准焦螺旋时，双眼要注视物镜与玻片之间的距离，到快接近（约0.5cm）时停止。

材料用具

金黄色葡萄球菌及枯草杆菌染色玻片标本、香柏油、二甲苯、显微镱、擦镜纸。

任务实施

一、实训步骤及操作标准

普通光学显微镜的使用及维护操作标准见表2－1。

二、实训报告

分别绘出在不同物镜下观察到的不同菌种的形态，同时注明放大倍数。

【问题思考】

1.油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？

2.显微镜中调节光线强弱的装置有哪些？

3.为什么在用高倍镜和油镜观察标本之前要先用低倍镜进行观察？

4.使用油镜观察时，为什么要在载玻片上滴加香柏油？

5.如何分析判断视野中所见到的污物点是在目镜上？

6.使用油镜时为什么必须干燥装片？