二、小反刍兽疫

小反刍兽疫俗称羊瘟，又名小反刍兽假性牛瘟、口炎肺肠炎复合症，是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性病毒性传染病，主要感染小反刍动物，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征。

1942年本病首次在象牙海岸发生，其后，非洲的塞内加尔、加纳、多哥、贝宁等有本病报道，尼日利亚的绵羊和山羊中也发生了本病，并造成了重大损失。亚洲的一些国家也报道了本病，根据国际兽疫局（OIE）1993年《世界动物卫生》报道，孟加拉国的山羊有本病发生，印度安德拉邦和马哈拉施特拉邦的部分地区绵羊中发生了类似牛瘟的疾病，最后确诊为小反刍兽疫，此后，泰米尔纳德邦也有受到感染报道。1993年，以色列第一次报道有小反刍兽疫发生，传染来源不明，为防止本病传播，以色列对其北部地区的绵羊和山羊接种了牛瘟疫苗。1992年，约旦的绵羊和山羊中发现了本病特异性抗体，1993年，有11个农场出现临诊病例，100多只绵羊和山羊死亡。1993年，沙特阿拉伯首次发现133个病例。

（一）病毒特征

小反刍兽疫病毒属副黏病毒科麻疹病毒属，与牛瘟病毒有相似的物理化学及免疫学特性。病毒呈多形性，通常为粗糙的球形。病毒颗粒较牛瘟病毒大，核衣壳为螺旋中空杆状并有特征性的亚单位，有囊膜。病毒可在胎绵羊肾、胎羊及新生羊的睾丸细胞、Vero细胞上增殖，并产生细胞病变（CPE），形成合胞体。

PPRV同属的还有海豚麻疹病毒、犬瘟热病毒、鼠海豹麻疹病毒、牛瘟病毒和麻疹病毒，PPRV只有一个血清型。PPRV基因组为单股负链RNA，大小为15948nt， 基因组3’末端为基因组启动子区，5’末端为反向基因组启动子区，6个基因排列顺序为3’-N-P-M-F-HL-5’，依次编码的6个结构蛋白为核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝蛋白 （H）和大蛋白（L），P基因还编码两个非结构蛋白C和V。

N蛋白通过自我组装形成核衣壳粒子，与P蛋白和L蛋白协同作用调控病毒RNA转录和复制。N蛋白还是保守性较强的免疫源性蛋白，当病毒感染时可以引起强烈的抗体反应。此外，N蛋白上含有T细胞表位，在细胞免疫方面发挥着重要作用。

根据N或F基因片段核苷酸序列，均可进行系统进化分析，结果显示PPRV分为4个基因系， Ⅰ系和Ⅱ系分布于西非，Ⅲ系病毒流行于东非、阿拉伯半岛（阿曼和也门）及印度南部，Ⅳ系仅见于中东、阿拉伯和印度次大陆。比较两种分别基于N和F基因部分序列的系统进化分析方法，N基因系统进化分析能更加有力地根据地理来源进行毒株的聚类， 分析结果体现了小反刍兽疫病毒在全球自西向东 （从西非到亚洲）的传播，并在4个区域分别进行独立的演变。而F基因系统进化分析更多地反映出病毒以时间为轴线的演变过程，从而为病毒在不同地理区域之间的传播途径提供线索。更具体的结果依赖于更多N或F基因全序列的报道。

（二）临床症状

由于动物品种、年龄差异以及气候和饲养管理条件不同而出现的敏感性不一样，临诊症状表现有以下几个类型。

最急性型：常见于山羊。在平均2d的潜伏期后，出现高烧（40～42℃），精神沉郁，感觉迟钝，不食，毛竖立。同时出现流泪及浆液性、黏性鼻涕。口腔黏膜出现溃烂（图1-56），或在出现之前即死亡。但常见齿充血，体温下降，突然死亡。整个病程5～6d。

急性型：潜伏期为3～4d，症状和最急性型一样，但病程较长。自然发病多见于山羊和绵羊，患病动物发病急剧，高热41℃以上，稽留3～5d，初期精神沉郁，食欲减退，鼻镜干燥，口、鼻腔流黏液脓性分泌物，并很快堵塞鼻孔，呼出恶臭气体。口腔黏膜和齿龈充血，进一步发展为颊黏膜出现广泛性损害，导致涎液大量分泌排出；从发病第5天起，黏膜出现溃疡性病灶，感染部位包括下唇、下齿龈等处，严重病例可见坏死病灶波及齿龈、颊部及其乳头、舌等处。舌被覆一层微白色浆性恶臭的浮膜，当向外牵引时，即露出鲜红和很易出血的黏膜。后期常出现带血的水样腹泻，病羊严重脱水、消瘦，并常有咳嗽、胸部啰音以及腹式呼吸的表现。死前体温下降。幼年动物发病严重，发病率和病死率都很高。母畜常发生外阴-阴道炎，伴有黏液脓性分泌物，孕畜可发生流产。病程8～10d，有的因继发感染而死亡，有的痊愈，也有的转为慢性型。

亚急性或慢性型：病程延长至10～15d，常见于急性期之后。早期的症状和上述急性型的相同。口腔和鼻孔周围以及下颌部发生结节和脓疱是本型晚期的特有症状，易与传染性脓疱混同。

（三）病理变化

尸体病变与牛瘟相似。PPR最特殊的病变是结膜炎、坏死性口炎等肉眼病变，严重病例可蔓延到咽喉部。开始为白色点状的小坏死灶，直径数毫米。待数目增多即汇合成片，形成底面红色的糜烂区，上覆以脱落的上皮碎片。在舌面、齿龈、上颚部位的溃疡很快被覆一层由浆液性渗出和脱落碎屑以及多核白细胞混合构成的黄白色浮膜。若无细菌性并发感染，这些病变很快痊愈。

在咽喉和食道经常有条状糜烂（每条长10余毫米，宽2～3mm）。鼻甲、喉、气管等处有出血斑。肺尖叶或心叶末端可见肺炎灶或支气管肺炎灶。瘤胃、网胃、瓣胃很少出现病变，皱胃则常出现糜烂病灶，其创面出血呈红色。肠道有糜烂或出血变化，特别在结肠和直肠接合处常常能发现特征性的线状出血或斑马样条纹。淋巴结肿大，脾有坏死性病变。慢性型口鼻周围和下颌部出现结节，直径5～20mm，表面粗糙黄灰色。这些病变在3周后逐渐痊愈。

（四）流行病学特征

易感动物：自然发病主要见于山羊、绵羊、羚羊、美国白尾鹿等小反刍动物，但山羊发病时比较严重，常呈最急性型，很快死亡。绵羊次之，一般呈亚急性经过而后痊愈，或不呈现病状。牛、猪等呈隐性感染，通常为亚临诊经过。2～18个月的幼年动物比成年动物易感，而哺乳幼畜抵抗力相当强。

人工感染时，绵羊、山羊和牛的反应与自然感染时的反应相同，只是注射比接触感染的潜伏期较短；猪被注射后可见抗体升高，而不见其他任何症状，猪和病山羊接触也不出现血清学反应，而且易感山羊也不被注射病毒的猪所感染。因而应认为猪在此病的流行病学上不起任何作用。

传染源：该病的传染源主要为患病动物和隐性感染者，处于亚临诊状态的羊尤为危险。病畜的分泌物和排泄物均含有大量病毒。

传播途径：本病通过直接接触患病动物和隐性感染者的分泌物和排泄物而传染，也可通过呼吸道飞沫传播。尚无间接感染病例的报告。

流行因素及形式：本病的流行无明显的季节性。在首次暴发时易感动物群的发病率可达100%，严重时致死率为100%；中度暴发时致死率达50%。但在老疫区，常为零星发生，只有在易感动物增加时才可发生流行。幼年动物发病严重，发病率和病死率都很高。

（五）预防及治疗

对本病尚无有效的治疗方法，发病初使用抗生素和磺胺类药物可对症治疗和预防继发感染。在本病的洁净国家和地区发现病例，应严密封锁，扑杀患羊，隔离消毒。对本病的防控主要靠疫苗免疫。

（1）牛瘟弱毒疫苗，因为本病毒与牛瘟病毒的抗原具有相关性，可用牛瘟病毒弱毒疫苗来免疫绵羊和山羊进行小反刍兽疫病的预防。牛瘟弱毒疫苗免疫后产生的抗牛瘟病毒抗体能够抵抗小反刍兽疫病毒的攻击，具有良好的免疫保护效果。

（2）小反刍兽疫病毒弱毒苗　毒常见的弱毒疫苗为Nigeria7511弱毒疫苗和Sungri/96弱毒疫苗。该疫苗无任何副作用，能交叉保护其各个群毒株的攻击感染，但其热稳定性差。

（3）小反刍兽疫病毒灭活疫苗　本疫苗系采用感染山羊的病理组织制备，一般采用甲醛或氯仿灭活。实践证明甲醛灭活的疫苗效果不理想，而用氯仿灭活制备的疫苗效果较好。

（4）重组亚单位疫苗　麻疹病毒属的表面糖蛋白具有良好的免疫原性。无论是使用H蛋白或N蛋白都作为亚单位疫苗，均能刺激机体产生体液和细胞介导的免疫应答，产生的抗体能中和小反刍兽疫病毒和牛瘟病毒。

（5）嵌合体疫苗　嵌合体疫苗是用小反刍兽疫病毒的糖蛋白基因替代牛瘟病毒表面相应的糖蛋白基因。这种疫苗对小反刍兽疫病毒具有良好的免疫原性，但在免疫动物血清中不产生牛瘟病毒糖蛋白抗体。

（6）活载体疫苗　将小反刍兽疫病毒的F基因插入羊痘病毒的TK基因编码区，构建了重组羊痘病毒疫苗。重组疫苗既可抵抗小反刍兽疫病毒强毒的攻击，又能预防羊痘病毒的感染。

（六）实验室检测

小反刍兽疫诊断技术

依据标准：GB/T 27982—2011。

1.实验室诊断

（1）样品采集与运输

1）样品的采条

① 每个发病羊群最少选5只病羊采集样品。

② 选择处于发热期（体温40～41℃）、排出水样眼分泌物、出现口腔溃疡、无腹泻症状的活畜采集样品。采集结膜棉拭子2个、鼻黏膜棉拭子2个、颊部黏膜棉拭子1个，分别放在300μl灭菌的0.01 mol/L pH7.4盐酸缓冲液（PBS）中。无菌采集血液10ml，用常规方法分离血清。

③ 选择刚被扑杀或者死亡时间不超过24h的病畜采集组织样品。无菌采集肠系膜和支气管淋巴结各3～4个，脾、胸腺、肠黏膜和肺等组织各25～50g，分别置于50ml离心管中。

④ 肉制品取25～50g，置于50ml离心管中。

2）样品的运输与储存

① 样品采集后，置冰上冷藏送至实验室检测。

② 血清储存应置于－20℃冰箱。

③ 棉拭子、病料组织和肉制品储存应置于－70℃冰箱。

（2）器械与设备　5%二氧化碳培养箱，DNA热循环仪，低温高速离心机，电泳仪和电泳槽，凝胶成像系统或者紫外检测仪，实时荧光定量PCR仪，96孔高吸附性酶标板，洗瓶或者洗板机，恒温箱，酶标仪。

（3）病分离与基定

1）试验材料　非洲绿猴（Vero）细胞，pH7.4磷酸盐冲液（PBS）（见附录A），细胞培养液（见附录A），细胞培养瓶。

2）样品处理　棉拭子充分捻动，挤干后弃去拭子，加入青霉素至终浓度200IU/ml，加入链霉素至终浓度200μg/ml，37℃作用1h，3000g离心10min，取上清液300μl作为接种材料。

用灭菌的剪刀、镊子取大约0.5g组织样品或肉制品，置于研钵中，剪碎，充分研磨，加入5ml 0.01mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液（含青霉素200IU/ml，链霉素200μg/ml），制成1∶10悬液。37℃作用1h。3000g离心10min，取上清液5ml作为接种材料。

不能立即接种者，应将上清放－70℃保存。

3）样品接种　取样品上清液接种已长成单层的Vero细胞，37℃恒温箱中吸附2h，加入细胞培养液，置5%二氧化碳培养箱37℃培养。

4）观察结果　接种后5d内，细胞应出现细胞病变效应，表现为细胞融合、形成多核体。如接种5～6d后不出现细胞病变，应将细胞培养物盲传三代。

5）病毒的鉴定　将出现细胞病变的细胞培养物，按“（4）RT-PCR方法”和“（5）荧光定量RT-PCR反应”做进一步鉴定。

6）结果判定　样品出现细胞病变，而且RT-PCR方法或实时荧光RT-PCR方法鉴定结果阳性，则判为小反刍兽疫病毒分离阳性，表述为检出小反刍兽疫病毒。否则，表述为未检出小反刍兽疫病毒。

（4）RT-PCR方法

1）试剂与材料　除另有规定外，试剂为分析或生化试剂。实验用水符合GB/T 6682的要求。

TRIzol试剂，三氯甲烷，异丙醇，无水乙醇，DEPC处理过的水（见附录B），反转录酶/Taq DNA聚合酶混合液，2×一步法RT-PCR反应缓冲液，1.5%的琼脂糖凝胶（见附录B），0.5×TBE缓冲液（见附录B），溴化乙锭。

可以采用引物NP3/NP4用于小反刍兽疫病核酸的检测，引物的靶基因、位置、序列和扩增产物的大小见表1-16。

2）样品处理　将棉拭子充分捻动，挤干后弃去拭子，取100L样品液至一新的离心管中，加入1ml TRIZOL试剂，振荡混匀，进行RNA提取。

取大约100mg组织样品，剪碎后，加入1ml TRIzol试剂充分匀浆后转移至1.5ml离心管中，进行RNA提取。

3）RNA提取　经IRIzol处理的样品液12000r/min，4℃离心10min，取上清，静置5min。加200L三氯甲烷，振荡混匀15s，静置2～3min，12000r/min，4℃离心15min，取400μl上层水相到新的离心管中，加400μl的异丙醇，混匀，静置10min，12000r/min，4℃离心10min，去上清。加入75%乙醇1ml，混匀，12000r/min，4℃离心5min，去上清。再加入75%乙醇1ml，混匀，12000r/min，4℃离心5min，去上清，干燥RNA沉淀后加入100μl DEPC处理过的水溶解，立即进行RT-PCR反应。或－70℃保存。

4）RT-PCR反应　反应体系为25μl，依次加入以下成分：12.5μl 2×一步法RT-PCR反应缓冲液，1μl正向引物NP3（10μmol/L），1μl反向引物NP4（10μmol/L），1μl反转录/Tag DNA合混合液，4.5μl DEPC处理过的水，5μl RNA模板。

每次进行RT-PCR反应时均设标准阳性、阴性及空白对照。标准阳性用阳性对照RNA作为模板，标准阴性用Vero细胞RNA作为模板，空白对照用DEPC处理过的水作为模板。

RT-PCR反应条件为：50℃反转录30min；94℃，2min进行Taq酶的激活；94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，共35次循环；72℃延伸7min。

5）PCR产物的电泳　取PCR产物5L在1.5%琼糖胶中进行电泳，胶成像系统中观察结果。

6）质控标准　小反刍兽疫病毒RT-PCR标准阳性对照有大小为351bp的特异性阳性扩增条带，标准阴性对照和空白对照无任何扩增条带，说明质控合格。

7）结果判定　样品有大小为351bp的特异性阳性扩增条带判为RT-PCR结果阳性，表述为检出小反刍兽疫病毒。

样品无特异性的阳性扩增条带判为RT-PCR结果阴性，表述为未检出小反刍兽病毒。

（5）荧光定量RT-PCR反应

1）试验材料　TRIzol试剂，三氯甲烷，异丙醇，无水乙醇，DEPC处理过的水（见附录B）、2×一步法荧光RT-PCR反应缓冲液，Taq DNA聚合酶，反转录酶，参比荧光ROXⅡ。

引物和探针：引物和探针针对小反刍兽疫病毒N基因保守序列区段设计，引物和探针的位置和序列见表1-17。

2）RNA提取　同（4）、3）。

3）荧光定量RT-PCR反应　反应体系为25μl，依次加入以下成分：12.5μl 2×1 step buffer，1μl正向引物PPRN8a（10μmol/L），1μl反向引物PPRN9b（10μmol/L），0.5pl探针PRN10p（10μmol/L），0.5μl TaqDNA聚合酶，0.5μl反转录酶，0.5μl参比荧光ROX，3.5μl DEPC处理过的水，5μl RNA模板。每次进行荧光定量RT-PCR时均设标准阳性、阴性及空白对照。标准阳性用阳性对照RNA作为模板，标准阴性用Vero细胞RNA作为模板，空白对照用DEPC处理过的水作为模板。

荧光定量RT-PCR反应条件为：42℃反转录30min；95℃，10min进行Taq酶的激活；95℃、15s，60℃、1min，共50次循环；每个循环在60℃、1min时收集荧光信号。

4）质控标准　读取每个样品的Ct值。

标准阳性对照样品有特异性扩增曲线而且Ct值≤30，标准阴性对照和空白对照无特异性扩增曲线，说明质控合格。

5）结果判定　样品有特异性扩增曲线而且Ct值≤40判为实时荧光RT-PCR扩增阳性，表述为检出小反刍兽疫病毒核酸。

样品Ct值>40或者无特异性扩增曲线判为实时荧光RT-PCR扩增阴性，表述为未检出小反刍兽疫病毒核酸。

（6）竞争 ELISA方法

1）试验材料　包被用抗原PPRV疫苗株重组N蛋白。对照血清：强阳性血清、弱阳性血清、阴性血清。单克隆抗体：小反刍兽疫病毒N蛋白的单克隆抗体。结合物：辣根过氧化物标记的山羊抗小鼠血清。封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物溶液及终止液，配制方法见附录C。

2）抗原包被　PPRV重组N蛋白用包被缓冲液1∶3500倍稀释后，每孔50μl包被96孔酶标板，37℃置湿盒吸附1h，用洗涤缓冲液洗板4次。

3）血清加样步骤　每孔加入45μl封闭缓冲液。每份待检血清做2孔，每孔加入5μl待检血清。设强阳性血清对照孔（C++）4个，每孔加入5μl强阳性血清，设弱阳性血清对照孔（C+）4个，每孔加入5μl弱阳性血清，设阴性血清对照孔（C－）2个，每孔加入5μl阴性血清，设单抗对照孔（Cm）4个，每孔加入5μl封闭缓冲液，设酶结合物对照孔（Cc）2个，每孔加入55μl封闭缓冲液。

4）单克隆抗体的加入　除结合物对照孔外，每孔加入50μl工作浓度的单抗，37℃置湿盒作用1h，用洗涤缓冲液洗板4次。

5）酶结合物的加入　每孔加入50μl工作浓度的酶结合物，37℃置湿盒作用1h，洗涤缓冲液洗板4次。

6）显色与终止　每孔加入50μl底物溶液，37℃避光反应10min，每孔加入50μl终止液。

7）读值　酶标仪预热15min，读取每孔492nm波长的吸光度值（OD值）。

8）计算抑制率　按照式（1-9）计算每孔（包括对照孔）的抑制率，并计算每份样品的平均抑制率。

PI=100－（ODr÷ODc）×100　　 （1-9）

式中　PI——抑制率；

　　　ODr——试验孔或对照孔OD值；

　　　ODc——单抗对照孔OD平均值。

9）质控标准　结果在质控标准（见表1-18）范围内，则试验成立。

10）结果判定　平均抑制率（PI）>80，判为强阳性；50<平均抑制率（PI）≤80，判为弱阳性，表述为小反刍兽疫血清学阳性。平均抑制率（PI）≤50，判为阴性，表述为小反刍兽疫抗体血清学阴性。

2.综合判定

凡具有1、（3）、6），1、（4）、7），1、（5）、5），1、（6）、10）中任何一项阳性者，均判为小反刍兽疫阳性。

附录A

（规范性附录）

病毒分离鉴定溶液的配制

A.1　pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）

NaCl　　　　　　　　　  8.00g

KCl　　　　　　　　　　0.20g

Na2HPO4·2H2O　　　　　1.44g

KH2P0.24g

用HCl调节溶液的pH值至7.4，加去离于水至1000ml，在1.034×105Pa高压下蒸汽灭菌20min。保存于室温。PBS一经使用，于4℃保存不超过3周。

A.2　高糖型DMEM培养液

高糖型DMEM　　　　　13.37g

碳酸氢钠　　　　　　　3.7g

超纯水　　　　　    　　1000ml

充分溶解后，0.22μm微孔滤圆过虑除菌。4℃保存。

A.3　细胞培养液

高糖型DMEM培养液　　　　950ml

胎牛血清　　　                    　50ml

加入青霉素至终浓度200IU/ml、链霉素至终浓度200μg/ml、两性霉素B至终浓度2.5μg/ml，充分混匀。4℃保存。

附录B

（规范性附录）

反转录-聚合酶链反应溶液的配制

B.1　DEPC处理过的水

DEPC　　　　　　　1ml

去离子水　　　            1000ml

充分混匀，将瓶盖拧松后置于37℃放置过夜，高压灭菌。

B.2　5×TBE缓冲液

Tris碱　　　　　　　  　54g

硼酸　　　　　　　　　27.5g

0.5mol/L EDTA　　  　　20ml

加去离子水调整体积至1000ml。

B.3　0.5×TBE缓冲液

取100ml 5×TBE缓冲液，加去离子水调整体积至1000ml。

B.4　1.5%的琼脂糖凝胶

琼脂糖　　　                            　0.75g

0.5×TBE缓冲液 　　　　　　　50ml

溴化乙锭溶液（10mg/ml）　　 2.5μl

称取0.75g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml 0.5×TBE缓冲液，加热溶解，冷却至50～60℃时加入2.5L溴化乙锭溶液，倒入胶槽内自然凝固。

附录C

（规范性附录）

竞争联免疫吸附试验溶液的配制

C.1　包被缓冲液——0.05mol/L pH9.6碳酸盐/重碳酸盐缓冲液

Na2CO3　　　  　0.318g

NaHCO3　　　 　0.588g

去离子水　　　　200ml

用0.22μm膜过滤除菌，室温保存备用。

C.2　洗涤缓冲液——pH7.4 PBST（0.05%吐温-20）

吐温-20　　　       　0.5ml

pH7.4 PBS　　　　1000ml

C.3　封闭缓冲液（含3%BSA的pH7.4 PBS）

BSA　　　            　30g

pH7.4 PBS　　　　1000ml

封闭液要临用前配制。

C.4　底物溶液

C.4.1　A液

Na2HPO4　　　           　3.682g

柠檬酸　　　　               1.021g

过氧化氢尿素　　　　　0.06g

去离子水　　　　   　　100ml

临用前配制，避光4～8℃保存。

C.4.2　B液

柠檬酸　　                                      　　1.05g

EDTA　　　　　　　　　　　　　　14.6mg

TMB（3，3’-二氨基联苯胺）　　　　25.0mg

去离子水用0.45μm滤膜过滤，临用前配制，避光4℃保存。

C.4.3　用法

使用时，将A液、B液按1∶1的比例混合。

C.5　终止液

浓硫酸　　　　　　　　　16.5ml

去离子水　　　　　　　　87.5ml

将浓硫酸缓缓加入蒸馏水中，混匀。