三、牛病毒性腹泻

牛病毒性腹泻（黏膜病）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV，属于黄病毒科瘟病毒属）引起的传染病，各种年龄的牛都易感染，以幼龄牛易感性最高。病毒可感染牛、羊、猪等多种家畜，尤以牛为主。感染牛可表现为多种临床症状，如肺炎、腹泻、流产、出血性综合征、急性感染及持续性感染等。该病分布广泛，世界上大多数养牛国家都存在，给养牛业造成了巨大的经济损失。我国自20世纪80年代初由国外引进的绵羊、奶牛和冻精中分离出该病毒。近年来，因大批地从外国引进种牛，使许多地区传入本病。因此，必须给予足够的重视。

（一）病毒特征

BVDV为黄病毒科、瘟病毒属。是一种单股RNA、有囊膜的病毒。新鲜病料作超薄切片进行负染后，电镜下观察可见病毒颗粒呈球形，直径24～30nm。病毒在牛肾细胞培养中，有三种大小不一的颗粒，最大的一类直径80～100nm，有囊膜，呈多形性，最小的一类直径只有15～20nm。

病毒对乙醚和氯仿等有机溶剂敏感，并能被灭活，病毒悬液经胰酶处理后（0.5mg/ml，37℃下60min）致病力明显减弱，pH5.7～9.3时病毒相对稳定，超出这一范围，病毒感染力迅速下降。病毒粒子在蔗糖密度梯度中的浮密度为1.13～1.14g/ml；病毒粒子的沉降系数是80～90S。

病毒在低温下稳定，真空冻干后在－70～－60℃下可保存多年。病毒在56℃下可被灭活，氯化镁不起保护作用。病毒可被紫外线灭活，但可经受多次冻融。

BVDV的分离株之间有一定的抗原性差异，但是用常规血清学方法区分病毒分离物之间的差异是非常困难的，一般认为一种BVDV产生的抗体能抵抗其他毒株的攻击。BVDV可在胎牛的肾、睾丸、脾、气管、鼻甲骨等牛源性细胞上生长，并且对胎牛睾丸细胞和肾细胞最敏感，做病毒分离时最好采用这两种细胞。BVDV也能在牛肾继代细胞（MDBK）上生长良好，因取用方便，所以常用MDBK和牛鼻甲骨细胞进行诊断实验和制造疫苗。病毒不能在鸡胚上繁殖。

（二）临床症状

本病自然感染的潜伏期为7～10d，短者为2d，长者为14d。人工感染的潜伏期多为2～3d。临诊上主要有如下表现形式：

急性型病牛呈双向热，病牛突然发病，体温升高至40～42℃，维持2～3d，下降后又第2次升高，流浆液性、黏性鼻液，咳嗽，呼吸急促，鼻镜、舌头、口腔黏膜糜烂，唾液增多，口气恶臭，继而发生严重的腹泻，排出青灰色恶臭水便，之后粪便变稠，混有大量黏液和气泡，有时混有血液。起初伴发蹄叶炎而见跛行，持续性或间歇性腹泻而迅速消瘦，急性的多于2周左右死亡，慢性的2～6个月后死亡。病毒可通过胎盘传染胎儿，导致出生的犊牛小脑缺陷或致流产。

（三）病理变化

主要表现为消化道黏膜有大量烂斑和溃疡，恶性卡他热消化道黏膜充血并有烂斑。食道黏膜有排列成直线形、大小不一的烂斑，鼻镜、口腔、咽喉有潜在的小烂斑；真胃水肿并有烂斑，小肠有急性卡他性炎症，大肠有糜烂、出血或坏死。

（四）流行病学特征

该病常发生于冬季和早春，舍饲和放牧牛都可发病。

家养和野生的反刍兽及猪是本病的自然宿主，自然发病病例仅见于牛，黄牛、水牛、牦牛没有明显的种间差异。各种年龄的牛都有易感性，但6～18月龄的幼牛易感性较高，感染后更易发病。绵羊、山羊也可发生亚临诊感染，感染后产生抗体。

病毒可随分泌物和排泄物排出体外。持续感染牛可终生带、排毒，因而是本病传播的重要传染源。本病主要是经口感染，易感动物食入被污染的饲料、饮水经消化道感染，也可由于吸入由病畜咳嗽、呼吸而排出的带毒的飞沫而感染。病毒可通过胎盘发生垂直感染。病毒血症期的公牛精液中也有大量病毒，可通过自然交配或人工授精而感染母牛。

（五）预防及治疗

目前无特效的治疗方法，对症治疗和加强护理可以减轻症状，增强机体抵抗力，促使病牛康复。

为控制本病的流行并加以消灭，必须采取检疫、隔离、净化、预防等兽医防制措施。预防上，我国已生产一种弱毒冻干疫苗，可接种不同年龄和品种的牛，接种后表现安全，14d后可产生抗体并保持22个月的免疫力。

（六）实验室检测

牛病毒性腹泻/黏膜病诊断技术规范

依据标准：GB/T 18637—2018。

1.病毒分离鉴定

（1）仪器　倒置荧光显微镜、倒置显微镜、台式离心机（最高离心速度不低于5000r/min）、超声波裂解仪、细胞计数仪、生物安全拒、恒温培养箱（37℃±2℃）、CO2恒温培养箱（37℃±2℃）、高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12000r/min）、涡旋混合荡器、研钵、组织匀浆器、冰箱（2～8℃、－20℃、－70℃）、单道（或多道）微量移液器（10μl、100μl、200μl、300μl、1000μl）。

（2）耗材　离心管（1.5ml、2ml、15ml、50ml、100ml）、采样管（5ml）、细胞培养瓶（25cm2、75cm2、175cm2）、细胞培养板（96孔、48孔、24孔、6孔）、移液器吸头（10μl、200μl、300μl、1000μl）、剪刀（含弯头剪刀）、镊子（含弯头镊子）、采样专用商品化棉拭子、一次性采血管（含针头）、注射器（5ml、10ml、20ml）、标签。

（3）试剂

PBS：配方见附录A。

PBST：配方见附录A。

细胞培养液与细胞维持液：配方见附录A。

BVDV阳性参照毒株：BVDV-1（Oregon C24V株）、BVDV-2（890株）。

FBS（无BVDV及其抗体）或马血清，－20℃保存。

中和试验对照血清：BVDV-1阳性血清、BVDV-2阳性血清和阴性血清（已56℃水浴灭活30min）。

病毒液：BVDV-1（Oregon C24V株）和BVDV-2（890株）分别接种MDBK细胞收获的培养物，测定TCID50后，分装于小管，－70℃以下保存备用。

细胞：MDBK传代细胞或BT传代细胞，细胞形态良好。

（4）试验步骤

1）制备单层细胞　将MDBK传代细胞或BT传代细胞用25%EDTA胰酶消化液消化分散后，用细胞培养液分散为浓度为1×106～2×106个/ml，分装细胞培养瓶，37℃恒温培养箱或5% CO2培养箱中静置培养24～48h，形成单层备用。

2）接种细胞　每份样品接种3瓶细胞，另设细胞对照2瓶。接种前，先弃去细胞培养瓶中的培养液，按最终细胞维持液体积的10%加入已经处理好的样品，37℃吸附2～3h，补加细胞维持液（配方见附录A）。细胞对照瓶不接种样品，弃去培养液后加入等量细胞维持液。均置于37℃恒温培养箱或5% CO2培养箱中培养。

3）观察和记录　每天观察并记录。如对照细胞单层完好，细胞形态正常或稍有衰老，接种病料的细胞如出现CPE，且70%以上细胞出现CPE时，取出并置－70℃以下冻存备用。无CPE的细胞瓶，于接种后96～144h，取出并置－70℃以下冻存备用。

4）盲传　将第1代无CPE的细胞培养物冻融3次后混合，3000r/min离心10min，取上清液按2）接种细胞，按3）进行观察、记录、收毒，盲传第2代。此过程中培养物仍无CPE则按同样的方法继续盲传第3代，培养结束后无论是否出现CPE均收毒，置－70℃以下冻存备用。取盲传3代的培养物进行检测。

5）荧光染色鉴定

① 按1）方法制备浓度为（1～2）×106个/ml的MDBK传代细胞或BT传代细胞，分装于96孔细胞板中，0.1mol/孔，将细胞板置于37℃、5% CO2培养箱中培养24h。

② 将3）和4）备用样品冻融3次后混合，3000r/min离心10min，取上清液接种于长成80%以上细胞单层的96孔细胞板中（接种前弃去培养板孔中的细胞营养液），0.1ml/孔，每个样品接种4孔，同时阳性对照BVDV-1毒株和BVDV-2毒株各接种4孔。设不接毒的正常细胞对照4孔。

③ 接种后细胞板置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养吸附2～3h，每孔补加维持液0.1ml，置37℃、5% CO2培养箱中继续培养72～120h，其间显微镜下观察每一个孔是否出现CPE。

④ 培养结束后，弃去细胞板孔中液体，用PBS轻轻洗涤一次，吸干，加入80%的冷丙酮，0.1ml/孔，4℃固定10～15min。

⑤ 固定好的样品进行免疫荧光染色，在倒置荧光显微镜下观察各细胞孔中的荧光情况并记录观察结果，具体操作如下：

a.弃去孔中丙酮，室温自然晾干。每孔分别加入FITC标记的抗BVDV荧光抗体（同时抗BVDV-1和BVDV-2）工作液50μl，37℃孵育1h；或每孔先加入牛抗BVDV-1和牛抗BVDV-2特异性阳性血清混合工作液或BVDV-1和BVDV-2单克隆抗体混合工作液50μl，37℃孵育1h后，PBS洗涤3次，再每孔加入FITC标记的抗牛IgG荧光抗体或FITC标记的抗鼠IgG荧光抗体工作液50μl，37℃孵育1h。

b.PBS洗涤3次后，弃去孔中液体。

c.在倒置荧光显微镜下观察各细胞孔中的荧光情况并及时记录，记录可分为：

（－）——无荧光；

（+）——荧光微弱，细胞形态不清晰；

（++）——荧光较亮，细胞形态清晰；

（+++－++++）——荧光较强，明亮闪烁，细胞形态清晰。

⑥ 根据荧光染色观察结果，按照以下条件及标准进行试验结果判定。

a.试验成立的条件如下：⑤、c.项正常细胞对照应为（－），2个阳性对照均应为（++）或（+++－++++），否则判为结果无效，应重检。

b.在试验成立的前提下，样品检测结果判定为：当⑤、c.项被检样品的结果为（++）或（+++－++++）时被检样品为BVDV阳性，当⑤ 、c.项被检样品结果为（+）时应重检，重检结果与首次结果一样时，判定被检样品为BVDV阳性。其他情况判定被样品BVDV阴性。

6）Real-time-PCR检测法鉴定

① 样品核酸提取　将3）和4）备用样品冻融3次后混合，3000r/min离心10min，取上清液，按2）提取核酸。

② 扩增试剂的准备与配制　按2、（4）、3）准备与配制扩增试剂。

③ 加样　按2、（4）、4）加样。

④ Real-time RT-PCR　按2、（4）、5）进行Real-time RT-PCR检测。

⑤ 结果判定　按2、（4）、6）进行结果判定。

7）综合结果判定

5）和6）可以单独使用或联合使用进行BVDV鉴定。当单独使用时，按照相应鉴定方法的结果判定进行检测结果判定。当联合使用时，按5）、⑥或（和）6）、⑤结果判定被检样品为BVDV阳性的，判定被检样品为BVDV阳性；按5）、⑥和6）、⑤结果判定被检样品均为BVDV阴性的，判定被检样品为BVDV阴性。

2.实时荧光RT-PCR检测

（1）仪器　台式离心机（最高离心速度不低于5000r/min）、高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12000r/min）、荧光PCR检测仪及配套反应管（板）、旋混合振荡器、冰箱（2～8℃、－20℃、－70℃）、单道微量移液器（5μl、10μl、100μl、200μl、300μl、1000μl）。

（2）耗材　无核酸酶离心管（1.5ml）、采样管（5ml、10ml）、剪刀（含弯头剪刀）、镊子（含弯头镊子）、采样专用商品化棉拭子、标签、PCR反应管、无核酸移液器吸头（10μl、200μl、300μl、100μl）。

（3）试剂

1）总则：除另有说明，所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均需使用无RNA的容器进行分装。

2）TRIzol（2～25℃）、氯仿（2～8℃）、异丙醇（－20℃）、 Catrimox-14，均为商品化试剂。

3）DEPC水：见附录A。

4）75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，－20℃预冷。

5）PBS（含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素）：配方见附录A。

6）BVDV Real time RT-PCR检测引物、探针序列，反应液配方见附录B。

7）Real-time RT-PCR试验阳性、阴性对照应满足以下要求：

① 阳性对照为灭活BVDV的细胞培养物（制备方法见附录C）或BVDV5’-UTR基因体外转录cRNA溶液（制备方法见附录C）。

② 阴性对照为正常MDBK传代细胞培养液或已知BVDV阴性的动物组织悬液。

（4）试验步骤

1）实验室的标准化设置与生物安全管理　本方法的实验室设置与管理见GB/T 19438.1—2004。

2）样品核酸提取

① 在样本制备区进行。采取TRIzol裂解法提取，也可采用其他等效的RNA提取方法，如柱式提取法。

② 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5ml离心管，逐管编号。

③ 每管加入600μlTRIzol。

④ 每管分别加入已处理的待检样品、阳性对照、阴性对照各200μl充分混匀。

⑤ 每管加入200μl氯仿，充分颠倒混匀。于4℃、12000r/min离心15min。

⑥ 新取n个灭菌的1.5ml离心管，逐管编号，每管加入500μl异丙醇。

⑦ 吸取⑤中各管中的上清液500μl，转移至⑥中相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀。

⑧ 于4℃、12000r/min离心15min，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，沥干液体，不同样品应在吸水纸不同位置沥干。

⑨ 逐管加入600μl 75%乙醇，颠倒洗涤。

⑩ 于4℃、12000r/min离心10min，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，沥干液体，不同样品应在吸水纸不同位置沥干。

⑪ 4000r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量移液器尽量将其吸干。

⑫ 室温干燥3min。

⑬ 每管加入25μl DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，获得RNA溶液，冰浴保存备用。

3）扩增试剂的准备与配制

① 在反应混合物配制区进行。

② 每个检测反应体系需使用15μl Real-time RT-PCR反应液。根据2）、②中设定的n值，按表1-22配制反应液，充分混匀后分装，每管15μl。转移反应管至样本制备区。

4）加样

① 在样本制备区进行。

② 在上述3）、②的反应管中分别加入2）、⑬中制备的RNA溶液10μl，使每管总体积达到25μl，记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。

5）Real-time RT-PCR

① 在检测区进行。

② 将在4）、②加样后的反应管放入荧光PCR检测仪内，记录反应管摆放顺序。选定FAM作为报告基团，BHQ1作为无荧光淬灭基团。反应参数设置如下：

a.第一阶段，反转录42℃/30min；

b.第二阶段，预变性94℃/3min；

c.第三阶段，92℃/15s，45℃/30s，72℃/60s，5个循环；

d.第四阶段，92℃/10s，56℃/60s，40个循环，在c.第三阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。试验结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。

6）结果判定

① 结果分析条件设定：根据仪器噪声情况对阈值进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照品扩增线的最高点为准。

② 质控标准同时满足以下两个条件，试验有效，否则，此次实验视为无效：

a.阴性对照应无Ct值并且无扩增曲线；

b.阳性对照的Ct值应≤28，并出现典型的扩增曲线。

③ 根据Ct值对实验结果进行描述及判定：

a.无Ct值，且无扩增曲线，表示样品中无BVDV核酸，判为阴性；

b.Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在BVDV核酸，判为阳性；

c.Ct值>35，且出现典型的扩增曲线的样品需复检。复检仍出现上述结果的，判为阳性。

附录A

（规范性附录）

溶液配制

以下所用试剂均为分析纯：

A.1　PBS配方

A.1.1　A液

0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液：NaH2PO4·H2O 27.6g，溶于去离子水中，最后定容至1000ml，备用。

A.1.2　B液

0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液：Na2HPO4·7H2O 53.6g（或NaH2PO4·12H2O 71.6g或Na2HPO4·2H2O 35.6g），加去离子水溶解，最后定容至1000ml，备用。

A.1.3　0.01mol/L pH7.2 PBS的配制

取A液14ml、B液36ml，加NaCl 8.5g，用去离子水定容至1000ml，经过滤除菌后，备用。

A.1.4　PBST的配制

取A液14ml、B液36ml，加NaCl 8.5g、0.5ml吐温-20，用去离子水定容至1000ml。经过滤除菌后，备用。

A.1.5　0.01mol/L、pH7.2 PBS（含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素）的配制

取A液14ml、B液36ml，加NaCl8.5g、牛血清白蛋白5g，用去离子水定容至1000ml，经过滤除菌后，无菌条件下分别按10000U/ml，加入青霉素和链霉素，备用。

A.2　细胞培养液与细胞维持液

A.2.1　细胞培养液

Eagle’s-MEM培养液　　　　87.5ml

FBS　　　                            　10ml

7.5%碳酸氢钠　　　           　1.5 ml

调节pH至7.2～7.4，充分混匀，现配现用。

A.2.2　细胞维持液

Eagle’s-MEM培养液　　　　95.5ml

FBS　　　                            　2 ml

7.5%碳酸氢钠　　　          　1.5ml

调节pH至7.2～7.4，充分混匀，现配现用。

A.3　DEPC水

将DEPC加入去离子水中至终浓度为0.1%，充分混匀后作用12h，分装，121℃±2℃高压灭菌30min，冷却后冷藏备用。

附录B

（规范性附录）

引物探针序列及Real-Time RT-PCR反应液配方

B.1　引物探针序列（见表1-19）

B.2　Real-Time RT-PCR反应液配方（表1-20）

附录C

（规范性附录）

Rel-time RT-PCR试验阳性对照制备方法

C.1　灭活BVDV的细胞培养物制备方法

取毒价达5.6×105TCID/0.1ml的 BVDV Oregon C24V毒株的细胞培养物，根据稀释后的体积添加0.5%甲醛溶液灭活，37℃过夜。

C.2　BVDV5’-UTR基因体外转录cRNA溶液制备方法

BVDV5’-UTR基因体外转录cRNA溶液，是通过回收BVDV Oregon C24V毒株5’UTR基因的RT-PCR扩增产物（引物序列见表1-21，反应液配方及反应条件见表1-22），长度为386bp，与pMD-T20载体进行连接，转化TOP10感受态细胞，裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒（命名为pMD20-BVDV-5U），再以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用试剂盒进行体外转录，将体外转录产物用Dnase除去其中的DNA模板再经TRIzol提取RNA进行浓度测定后，即得到制备BVDV阳性对照所需的RNA阳性对照品母液。将母液10倍系列稀释之后，可作为 BVDVReal-time RT-PCR方法的阳性对照使用。