3.2　基因编辑技术的发展

基因编辑技术，着眼于生物体基因组特定位点的精确修饰，通过对基因片段的敲除、敲入及替换，实现对生物体某一特性或性状的改变。Thomas等[1]于1986年利用基因打靶技术，将抗药基因成功导入了新霉素抗药缺陷细胞，重新恢复了细胞的抗药性，这是最早报道的基因编辑技术的实际应用。随着基因编辑技术不断发展完善，先后出现了人工锌指核酸酶（ZFN）技术、类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）技术，与传统基因编辑技术相比，新型技术具有更高的效率和打靶准确率，在生物基础研究、基因治疗、遗传改造等领域展现了巨大的潜力。

作为第一代人工基因编辑技术，锌指核酸酶（ZFN）技术是由锌指蛋白（ZFP）结构域和FokⅠ核酸内切酶切割结构域融合而成的人工嵌合核酸内切酶[2]。ZFN技术的基本原理是利用ZFP对DNA序列的特异性识别能力和二聚化FokⅠ酶对DNA的切割能力，使DNA产生双链断裂，完成对DNA片段的特异性切割。因为一个锌指单元可以识别一个核苷酸三联体，所以可以通过人工设计，联合不同的锌指单元，识别不同的DNA序列。

ZFN能够对完整细胞的染色体进行切割，并促进同源重组的发生[3]，所造成的基因组改变无法逆转，因此只需要瞬时转染表达即可。利用质粒、病毒载体、mRNA转染和直接添加蛋白质的方式均可对体外培养的哺乳动物细胞进行ZFN转导。ZFN mRNA可成功注射到早期胚胎的原始生殖细胞中，并可以在多种种系成功表达。但是也有研究发现，向非洲爪蟾卵母细胞中注射人工修饰模块，细菌FokⅠ核酸酶在该环境下无法正常识别这些序列，同时，有文献证明植物对基因编辑试剂的传递，暗示了ZFN转染方式选择的重要性。秀丽隐杆线虫实验和斑马鱼实验均揭示了该技术应用范围存在一定的局限性。此外，ZFN高表达时，脱靶效应的存在所产生的毒性也限制了该技术的应用。

TALEN技术与ZFN技术的作用原理类似。TALE蛋白是来源于植物病原菌黄单胞菌的转录因子，通过识别特异的DNA序列，进而激活宿主植物内源基因的表达，以提高宿主对该病原体的易感性。TALE蛋白由三部分组成，分别为核定位信号、转录激活结构域和DNA识别结构域。2009年植物遗传学家发现其DNA识别区域具有阻止其与DNA单链结合的功能。TALEN技术主要利用TALE蛋白中的DNA识别结构域与核酸内切酶（通常来源于FokⅠ限制酶）切割结构域，融合设计得到TALEN，用于基因编辑，作用于多种组织和细胞系中。TALE蛋白中的DNA识别结构域由多个串联重复单体组成，每个单体能够识别一种氨基酸[4,5]。每个单体的序列是高度相似的，只有第十二位和第十三位的氨基酸组成不同。这两位氨基酸被称为重复可变双残基（repeat variable di-residue, RVD）。组成DNA的四种不同的脱氧核糖核苷酸只需要四种不同的单体即可识别，在序列设计方面，TALEN技术比ZFN技术更易于操作，并且TALEN技术的靶向识别特异性更强。

2013年，Zhang等[6]开发了利用CRISPR-Cas系统对基因靶向编辑的新技术，大幅度提高了基因编辑的效率和可靠性。CRISPR是指簇状规则间隔短回文重复序列，Cas即CRISPR相关蛋白。CRISPR-Cas9基因组编辑系统介导的基因组编辑技术也叫作RNA指导的核酸内切酶（RNA-guided endonuclease, RGEN）系统，与前两种技术相比，CRISPR-Cas技术的成本低廉，guide-RNA设计简便易得，可操作性强。与TALEN方法相比较，对同一基因进行修饰编辑的修饰效率分别是0%～34%和51%～79%，显示了CRISPR-Cas基因编辑技术的高效性。CRISPR-Cas成为第3代新型基因编辑技术，适用于包括生物技术、医药及临床在内的多个领域，掀起了国内外基因编辑研究的热潮。