3.4 CRISPR-Cas系统的应用进展
3.4.1 在细菌及古菌中的应用
如前所述，CRISPR-Cas系统广泛分布于几乎所有的古菌（约90%）和多数细菌（约50%）中[21]。2013年，Jiang等将CRISPR-Cas9技术与同源重组（homologous recombination, HR）修复技术共同应用于基因组编辑[22]。发生同源重组的细菌因Cas9不能继续切割靶基因得以存活，未发生同源重组的细菌则被持续切割而死亡。利用同样的策略在拜氏梭菌[23,24]、放线菌[25,26]、解纤维梭菌[27]等菌种中均能成功实现基因编辑。Penewit等在金黄色葡萄球菌中开发了重组工程和CRISPR-Cas9介导的反选择条件系统，在金黄色葡萄球菌基因组中有效和精确地设计了点突变和大的单基因缺失[28]。
CRISPR-Cas9介导的单链DNA（single-stranded DNA, ssDNA）重组可以在谷氨酸棒杆菌的基因组中精确地引入小的修饰和单核苷酸改变，效率超过了80.0%[29]，同样，也有获得抗L-脯氨酸反馈抑制高产菌株的报道[30]。
区别于上述研究中的利用同源重组修复技术的思路，祁庆生团队开发了CRISPR-Cas9辅助的非同源末端连接（CA-NHEJ）策略，赵国屏团队则在大肠杆菌中引入Cas9及耻垢分枝杆菌的NHEJ系统，通过进一步的设计，该系统可进行连续的基因失活或DNA片段删除[31]。通过引入DNA结合蛋白Ku和连接酶LigD来补救细菌的NHEJ修复途径，可以有效地提升CRISPR系统的编辑效果。此外，单碱基编辑系统很好地弥补了DSB应用于基因校正易导致突变的缺点，该策略成功引入到金黄色葡萄球菌、假单胞菌、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌中，实现了高效的C→T碱基编辑，通过快速、有效的遗传操作，加速了相关菌属细菌生理学的深入研究[32-34]。
3.4.2 在真菌中的应用
CRISPR-Cas9技术在酿酒酵母中的应用始于2013年，DiCarlo等[35]将携带sgRNA的质粒与供体DNA同时转至含有组成型表达的Cas9细胞中，同源重组率接近100%，且单、双链靶基因断裂效率分别提高5倍和130倍。Bao等[36]构建了HI-CRISPR（homology-integrated CRISPR-Cas），实现了一步多基因敲除，拓展了酿酒酵母的多基因编辑研究。裂殖酵母的基因编辑工作报道于2014年，Jacobs等[37]利用RNA（rrk1）的启动子与组成型Cas9相结合，成功开展了无筛选标记的特异性诱变，实现了精确、高效的基因组编辑。Shapiro等[38]开展了在白色假丝酵母中的应用，基于CRISPR-Cas9技术，在二倍体病原体中进行基因操作及快速形成突变体，为白色念珠菌致病机制和耐药性研究提供了新的途径。
丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）是重要的工业生产菌株，Liu等[39]于2015年建立了适用于里氏木霉的，可以同时编辑多个靶基因的CRISPR-Cas9系统，靶基因高效率同源重组，为其功能基因组学和菌种的优选、优育研究奠定了坚实的基础。Katayama等[40]利用CRISPR-Cas9体系对米曲霉（Aspergillus oryzae）基因组进行了编辑，证明单碱基的缺失或插入突变不会影响米曲霉的生长，为后续工业菌株的定向诱变研究提供了可能。Zhang等[41]在烟曲霉（Aspergillus fumigatus）中建立了以CRISPR-Cas9技术为基础的微生物学介导的末端连接（microhomology-mediated end joining, MMEJ）靶基因突变系统，实现了高效的靶基因编辑。在水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）[42]和玉米黑粉菌（Ustilago maydis）[43]中，均有应用CRISPR-Cas9系统成功进行基因编辑的报道。
2016年，有人利用CRISPR-Cas9技术对双孢蘑菇（Agaricus bisporus）中控制褐变的多酚氧化酶基因进行了基因编辑，成功降低酶活性30%，这是基因编辑技术在大型真菌中的首次应用[44]。2017年，Sugano等[45]构建了应用于灰盖鬼伞（Coprinopsis cinerea）的高效基因组编辑体系，高通量筛选获得高出常规启动子活性7倍的新启动子——CcDED1pro，在稳定的GFP表达体系中进行CRISPR-Cas9介导的GFP诱变，在菌丝和子实体中检测到了GFP功能的丧失。Qin等[46]在灵芝（Ganoderma lucidum）中成功应用CRISPR-Cas9系统，靶向破坏了阻碍灵芝酸合成的URA3基因，转化效率达66.6%。在虫生真菌的研究中，Chen等[47]通过密码子偏好性，优化Cas9与启动子Pcmlsm3和终止子Tcmura3一起表达，构建了应用于蛹虫草的CRISPR-Cas9系统。
3.4.3 在植物细胞中的应用
自2013年以来，基于CRISPR的基因组编辑和定点诱变技术在植物中已广泛应用。以拟南芥（Arabidopsis thaliana）和本塞姆氏烟草（Nicotiana benthamiana）作为模式植物，早期相关研究主要集中在此，表型效应验证了预期的突变，证明了CRISPR-Cas技术在植物基因组编辑中的应用潜力。由于CRISPR系统的精确性和高效性，CRISPR-Cas系统已广泛应用于不同靶基因的多种作物，诸如高粱[48]、大豆[49,50]、番茄[51]、马铃薯[52]、葡萄[53]等已被定向突变和修饰。
Kim等[54]利用CRISPR-Cas12a系统成功地对大豆的FAD2基因和烟草的AOC基因进行了编辑。Wang等[55]同样利用CRISPR-Cas12a系统多基因编辑的优点成功对水稻进行了多基因的编辑。Cas13作为通用的RNA靶向工具，已被应用作为特异性敲除植物细胞的工具。CRISPR-Cas技术的研究还整体应用于重要的粮食作物，例如小麦[56,57]和水稻[56,58]。2017年3月，Nature Plants刊文表明了AsCpf1和LbCpf1用于编辑植物基因组和调控植物转录的可行性[59]。CRISPR-Cas应用于植物基因表达调控、表观基因组学和遗传育种等领域的潜力巨大。
3.4.4 在动物细胞中的应用
CRISPR系统定位精确，该系统的组成部分可用于在大多数生物的基因组中产生特异性突变。这引起了研究人员对CRISPR系统及其随后在基因组编辑中应用的研究的巨大兴趣。2013年，多个实验室成功实现了对小鼠细胞的单基因、双基因及多基因的敲除[60-62]。同年，Hwang等[63]利用CRISPR系统成功在斑马鱼胚胎中进行基因的定点修饰，为脊索动物的研究提供了合适的模式生物。Friedland等[64]用显微注射法将携带gRNA/Cas9的质粒转入秀丽线虫胚胎中，实现了个体水平的基因敲除。2014年，中国科研人员首次利用CRISPR-Cas9对食蟹猴进行精确基因编辑，获得了一批定向突变的基因工程猴[65]，由于灵长类动物与人类同源性较高，这一研究为之后人类疾病的研究提供了很好的模型。2014年，有人[66]用CRISPR系统将致癌突变基因导入成年小鼠肝脏中，建立携带癌基因的小鼠模型，大大降低了研究成本，为癌症的多方面研究提供了便利。在肿瘤的临床治疗研究中，CRISPR-Cas9技术还被应用于直接攻击癌细胞中的关键基因和通过编辑免疫细胞攻击癌细胞。
靶向基因组的多重基因编辑及其他新型CRISPR效应物如Cpf1的鉴定和开发，使得CRISPR系统成功地编辑了人、大鼠和斑马鱼等动物细胞。张锋课题组使用CRISPR-Cas9系统首次展示了人类细胞培养物的功能基因组编辑[67]。谷峰课题组在Nucleic Acids Research杂志发表了题为“A new lease of life: FnCpf1 possesses DNA cleavage activity for genome editing in human cells”的研究论文[68]，首次提出FnCpf1在人类细胞中存在颇为可观的切割效率，并系统测定了FnCpf1的相关参数，该结果更新了张锋教授对Cpf1的研究结论。作为CRISPR 2类系统中Ⅴ型核酸酶，Cpf1展现出显著区别于CRISPR-Cas9的编辑特点：仅需要一个crRNA分子协助（无需tracrRNA组装，并可在体内同时编辑多个基因）[69]；PAM序列显示出类似于5′-TTN-3′或5′-TTTN-3′的选择性（而spCas9的PAM序列为3′-NGG-5′）；不同于Cas9在PAM位点附近产生平端裂解产物，Cpf1在种子序列的远端产生交错的双链断裂[70]；在人类细胞全基因组范围内，Cpf1具有较高特异性[71]。以上这些编辑特点使Cpf1被认为是一种非常有用的基因组编辑工具。自问世以来，Cpf1在基因组编辑研发和应用上日新月异。2016年8月，Nature Biotechnology同时在线刊载两篇利用AsCpf1和LbCpf1获得基因敲除小鼠的论文，2017年3月发表的Science Advance，首次报道了利用AsCpf1和LbCpf1在人类细胞和疾病模型小鼠中实现高效的基因修复[72]。