3.5　CRISPR-Cas系统的前瞻性应用

利用现代冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术开展的结构生物学研究，证实了Cas9-sgRNA-靶DNA复合物的存在，揭示了sgRNA和CRISPR-Cas9以及靶DNA和CRISPR-Cas9分子之间相互作用的分子机制。研究增强Cas9靶向识别特异性和DNA结合能力，将为进一步优化Cas系统，改进下一代CRISPR技术奠定基础。后续研究中，黄志伟教授课题组对LbCpf1-crRNA核糖核蛋白复合物晶体结构的解析，揭示了Cpf1识别crRNA和剪切pre-crRNA的分子机制[73]。多个课题组先后对AsCpf1-crRNA-DNA三元复合物晶体结构的成功解析，阐明了Cpf1识别和剪切DNA机制，比较了与Cas9识别和剪切目的基因机制的异同。Cpf1识别目标DNA时种子序列“从无序到有序”和PAM互作裂缝“从开到关”的构象变化，可能有利于降低其基因编辑的脱靶效应。

CRISPR-Cas12a（Cpf1）的发现及应用极大地扩展了基因编辑靶位点的选择范围，弥补了CRISPR-Cas9系统的诸多不足，是CRISPR-Cas9系统的有力补充，提高了CRISPR-Cas系统的多基因编辑能力[74]。CRISPR-Cas13系统特异性结合RNA，对RNA有高度编辑能力，进一步扩展了CRISPR-Cas系统的基因编辑范围[12]，开启了转录组研究的新篇章。同时CRISPR技术在功能基因筛选、转录调控、表观遗传调控以及DNA成像等领域有着巨大的应用前景。例如，基于CRISPR-Cas9和TALE转录控制方法开辟了合成生物学新领域[75,76]。Nissim等[77]通过结合多种RNA修饰系统，针对RNA的三螺旋结构、内含子、小分子RNA和核糖核酸酶，利用CRISPR转录调控手段建立了详尽的基因网络。

Kearns等[78]发现，利用CRISPR系统，dCas9-LSD1可以以高度特异的方式，功能性地靶向调控增强子元件，从而开拓了解析特殊位点上组蛋白目标修饰，进行表观遗传标记（如组蛋白甲基化和乙酰化）调控功能研究的新领域。dCas9与效应蛋白GFP融合，配以靶向基因组特定位置的gRNA，在活细胞内实现了基因组特定位点的标记，开拓了细胞核内基因组的三维结构及动态变化研究，以及三维空间结构对于基因表达和细胞命运的决定所起到的关键调节作用研究的新领域[79]。Abudayyeh等[80]证实了Cas13a酶能够特异性地降低哺乳动物细胞中的内源性RNA和报告RNA水平，效率高于RNA干扰（RNAi），能被用于抑制靶标RNA、结合和富集感兴趣的RNA以及通过序列特异结合对细胞内的RNA进行成像。CRISPR-Cas13d被鉴定并在体内重组以调节剪接[81]。随着RNA导向的RNA靶向工具箱的发展，dCas13a被应用于RNA成像[80]和核酸检测与诊断[82]。

CRISPR-Cas碱基编辑器技术可实现靶向核苷酸改变，正在迅速应用于研究并具有潜在的治疗价值。最广泛使用的碱基编辑用酶是大鼠APOBEC1（rAPOBEC1）酶，该酶诱导DNA胞嘧啶（C）脱氨，该系统由连接的Cas蛋白+gRNA+APOBEC1组成。2019年4月17日，J. Keith Joung课题组在Nature在线发表Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors[83]，证明：具有rAPOBEC1的CBE可以在人类细胞中引起广泛的转录组范围的RNA胞嘧啶脱氨基，诱导数万个C-尿嘧啶（U）编辑，频率范围为0.07%至100%，发生范围是38%～58%表达的基因。CBE诱导的RNA编辑在蛋白质编码序列和非蛋白质编码序列中发生，并产生错义突变、无义突变、剪接位点、5′UTR和3′UTR突变。带有rAPOBEC1突变的CBE变体可以显著降低人类细胞中RNA编辑的数量。