4.3　Cas9酶

化脓链球菌Cas9（SpCas9）是一种大型的（1368个氨基酸）多结构域和多功能的DNA核酸内切酶。它通过两个不同的核酸酶结构域在PAM上游3bp处剪切dsDNA。Cas9的两个结构域中一个是HNH样核酸酶结构域，它切割与向导RNA序列互补的DNA链（靶链）；另一个是RuvC样核酸酶结构域，负责切割与靶链互补的DNA链（非靶链）[20,27]。除了在CRISPR干扰中起关键作用外，Cas9还参与crRNA成熟和间隔区获取[28]。

4.3.1　Apo酶的双叶结构

Apo状态的Cas9结构具有两个不同的叶，α-螺旋识别（REC）叶和核酸酶（NUC）叶，后者包含保守的HNH和分成几部分的RuvC核酸酶结构域以及可变性更高的C端结构域（CTD）[29]。这两个叶通过两个连接段进一步连接：一个连接段由富含精氨酸的桥螺旋形成，另一个由无序的连接段组成（残基712～717）。REC叶由三个α-螺旋结构域（Hel-Ⅰ、Hel-Ⅱ和Hel-Ⅲ）组成，与其他已知蛋白质没有结构相似性。延伸的CTD显示Cas9特异性折叠，包含PAM识别所需的相互作用位点。但是，该PAM识别区域在Apo-Cas9结构中无序，这表明Apo-Cas9处于非活性状态，在结合向导RNA之前无法识别靶DNA。这种结构观察与所谓的DNA幕帘分析结果一致，后者显示Apo-Cas9非特异性结合DNA，在竞争RNA（如向导RNA）存在的情况下，它可以从非特异性位点快速解离下来[30]。将结合sgRNA和结合DNA的两种Cas9结构与Apo-Cas9的结构叠加会发现，Cas9在Apo状态下处于失活状态，需要RNA诱导激活来进行DNA识别和切割。这一发现与生化实验结果一致，即在不结合向导RNA的情况下，Cas9作为核酸酶是无活性的[20]，进一步支持验证了其具有RNA引导的核酸内切酶的功能[29]。

4.3.2　HNH和RuvC核酸酶结构域

将Cas9核酸酶结构域与其他结合DNA的核酸酶的同源结构比较后发现，Cas9 RuvC核酸酶结构域与具有RNase H折叠特征的逆转录病毒整合酶超家族成员具有结构相似性，表明RuvC可能使用双金属离子催化机制切割非靶DNA链[29,31]。相反，HNH核酸酶结构域具有其他HNH核酸内切酶共有的标志性ββα-金属折叠方式，很有可能采用单金属离子机制进行靶链DNA切割。单金属离子依赖性和双金属离子依赖性核酸内切酶的标志分别是广义保守的碱性组氨酸残基和绝对保守的天冬氨酸残基[32]。这与Cas9的突变研究结果一致。该研究表明，突变HNH（H840A）或RuvC结构域（D10A）会将Cas9转化为切口酶，而同时突变Cas9的两个核酸酶结构域（所谓的“死Cas9”或dCas9）则会保留其RNA引导的DNA结合能力，尽管会丧失核酸内切酶活性[20]。这些假设的催化机制正不断被最新的实验数据加以证实。