4.4　CRISPR-Cas9效应复合物的组装

要实现位点特异性的DNA识别和切割，需要将Cas9与向导RNA（天然的crRNA-tracrRNA或sgRNA）组装在一起以形成活性的DNA监测复合物[20,29]。crRNA的20nt间隔区序列赋予DNA靶向特异性，tracrRNA在Cas9募集和crRNA成熟过程中起关键作用[25]。遗传和生物化学实验确定了crRNA间隔区中RNA的所谓种子区域的作用，该区域对于靶标特异性非常重要[33,34]。在Ⅱ型CRISPR系统中，种子区域被定义为位于20nt间隔序列3′末端、PAM近端的10～12个核苷酸[3,20,30]。种子区域的错配会严重影响或完全解除靶DNA的结合和切割，而种子区域的高度同源性会导致脱靶结合[35]。

4.4.1　sgRNA结合后的构象重排

在靶标识别之前进行的Cas9-sgRNA组装和向导RNA排列，其原理在结合sgRNA的晶体结构中得到了阐释[36]。结合sgRNA的Cas9与Apo-Cas9的结构比较准确地揭示了向导RNA结合如何驱动Cas9从无活性构象到有DNA识别能力构象的实质性结构重排。最显著的构象变化发生在REC叶中，尤其是Hel-Ⅲ，它在sgRNA结合后向HNH结构域移动约65°。相反，Cas9结合靶DNA和PAM序列后的构象变化要小得多，这表明大多数的结构重排发生在靶DNA结合之前，强化了向导RNA装载是Cas9酶功能关键调节因子的观点[29]。

4.4.2　Cas9与sgRNA的相互作用

Cas9与sgRNA之间存在广泛的相互作用。具体来讲，sgRNA的部分碱基相互配对形成双链和茎环结构，Cas9与重复-反重复序列双链、茎环1以及茎环1和2之间的连接区（通过Hel-Ⅰ，富含精氨酸的桥螺旋和CTD结构域）直接接触。相比之下，Cas9通过其RuvC和CTD结构域与sgRNA的茎环2建立的相互作用要少得多。由于用于晶体结构分析的sgRNA中缺少tracrRNA 3′尾部，在Cas9-sgRNA结构中未见到茎环3的蛋白质-RNA相互作用。但是，结合靶标DNA的结构显示Cas9与茎环3的接触很少[31,37]。生化研究表明，尽管效率很低，缺失茎环1和2之间的接头区域，茎环2和茎环3的sgRNA仍然能够触发Cas9介导的DNA切割，而缺失茎环1则使Cas9-sgRNA完全丧失了切割能力[20]。功能研究表明，茎环2和/或3对于Cas9在体内发挥活性是必需的[31]。综上所述，Cas9-sgRNA复合物的形成不可缺少重复-反重复序列双链和茎环1，而茎环1和茎环2的连接子、茎环2和茎环3不是监测复合物发挥功能所必需的[38]，但可以通过稳定向导RNA结合促进活性复合物的形成，从而提高体内的催化效率[3,31,38]。

4.4.3　预排序种子RNA以及Cas9与PAM的相互作用

Cas9与向导RNA的核糖-磷酸骨架广泛接触，从而以某种构象形式对起始DNA识别所需的10nt RNA种子序列进行了预排序。这种预排序被认为使靶标结合在热力学上变得有利，这与在其他小调节性RNA通路中观察到的向导RNA定位类似，包括细菌Hfq蛋白-RNA复合物和真核Argonaute介导的RNA沉默相似[39]。值得注意的是，在被称为Cascade的Ⅰ型CRISPR干扰复合物中，向导RNA在整个crRNA中被预排序而不局限于种子区域。这可能是由两方面所致：一是复合物的螺旋组装方式，二是在每六个核苷酸位置处完全翻转出核苷酸释放了拓扑约束[40]。除了预排序的种子向导RNA序列外，Cas9上负责识别5′-NGG-3′PAM的关键位点R1333和R1335在与靶DNA接触之前也已被预先定位，表明sgRNA装载使Cas9形成了能识别DNA的结构特征。值得注意的是，尽管5′端的10nt非种子RNA序列在sgRNA结合的晶体结构中完全无序[36]，但结合全长sgRNA的SpCas9的电子显微镜（EM）结构（EMD3276）显示向导RNA的5′末端位于HNH和RuvC结构域之间形成的腔内[37]。此结构表明sgRNA的5′末端受到保护免于降解，而在靶DNA结合的过程中，需要进一步的构象变化才能从原先的限制中释放出来。