1.1　引言

在基因工程领域，簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白（Cas）系统的研究和应用近年来取得了巨大进展。现在已经开发出了多种CRISPR-Cas9作为基因组编辑工具。迄今为止，所有CRISPR-Cas系统被归为两类，每个类别又进一步分为几种亚型。由于目前CRISPR-Cas领域还有多种应用工具正处于开发阶段，许多研究团队和公司也正就这些系统的专利权争吵不休。本章将就CRISPR-Cas系统做一个简短的概述。

自从Ishino等在1987年发现CRISPR-Cas系统以来[1]，CRISPR-Cas系统已发展成为一种基因编辑的强大工具。Mojica等在20世纪90年代完成了CRISPR-Cas系统的大部分初始表征工作[2]，而CRISPR的名字则是由Jansen等在2002年首次提出的[3]。自那时起，人们开始了CRISPR-Cas系统所涉及的蛋白质和分子的发现和表征过程[4]。以2类Ⅱ型的CRISPR-Cas9系统为例[4-6]，CRISPR-Cas系统进行基因编辑包括三个过程：表达、干扰和适应（匹配）[4,5]。在表达过程中，与特定靶序列（原间隔序列）同源的CRISPR阵列被转录为许多前CRISPR RNA（pre-crRNA）[4-6]［图1.1 （a）］，这些pre-crRNA与更小的反式激活crRNA（tracrRNA）通过碱基配对形成复合物[4-6]。这种复合物可以与Cas9蛋白结合，导致较长的pre-crRNA被RNA酶Ⅲ切割，分离成单独的crRNA/tracrRNA复合物［图1.1 （b）］。当crRNA/tracrRNA将Cas9复合物引导至目标序列时，crRNA结合所谓的原间隔序列相邻基序（PAM）后的目标序列，干扰就开始了［图1.1 （c）］。在此阶段靶序列解旋，并被Cas9蛋白的核酸酶结构域（RuvC和HNH）切割[4-6]，在靶DNA序列中留下断裂双链，然后Cas9复合物脱离。之后是将所需的DNA修复模板插入，并在干扰的末期通过同源定向修复（HDR）将其连接至经切割的靶DNA的平末端。修复的间隔区序列被转录并匹配嵌入基因组［图1.1 （d）］[4-6]。在大多数已知的CRISPR-Cas系统中，适应过程由Cas1和Cas2蛋白（在某些时候为Cas4）控制，这些蛋白质通过整合RNA，然后诱导RNA逆转录成DNA，从而将所需的间隔区序列匹配入CRISPR阵列[4-6]。通过这些过程，某些细菌能够在感染过程中将病毒基因组整合到自己的基因组（即CRISPR阵列）中，从而在将来的感染过程中实现更有效的免疫反应[4-7]。这些过程经过修改，就成为了分子生物学和基因工程领域的强大工具。

图1.1　CRISPR-Cas系统进行基因编辑的过程

（a）来自CRISPR阵列的crRNA与较小的tracrRNA分子结合，成为gRNA复合体；（b）gRNA与Cas9蛋白结合，形成gRNA：Cas9复合物；（c）gRNA指导Cas9蛋白识别PAM基序并靶向特定的DNA序列，RuvC和HNC核酸酶位点切割靶序列，留下两个同源的平末端；（d）所需的DNA修复模板插入所需的基因并通过HDR修复DNA链，然后使产物DNA适应匹配插入生物体的基因组