1.4.5　菌群的分子生物学诊断

已有的研究表明，复杂环境微生物分离纯化困难，绝大多数属“未培养菌”。为此，基于16S rDNA（原核生物）、18S rDNA（真核生物）及特定功能基因的分子生态学手段被广泛应用，提高了厌氧发酵诊断的效率和准确性。其中，遗传指纹技术是研究菌群结构及动态变化的常规手段，但由于不能进行定量分析，需要与稳定性同位素标记（stable-isotope probing，SIP）、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）及定量PCR（quantitative polymerase chain reaction, q-PCR）等技术结合，监控特定菌群[42]。高通量测序技术（NGS）将为厌氧发酵诊断提供新的选择，环境基因组学（metagenomics）被用于厌氧菌群结构分析、功能活性及环境微生物相互作用研究[91，137，138]。而转录组学（metatranscriptomics）、代谢组学（metabolomics）及蛋白组学（metaproteomics）则可以在转录、功能蛋白表达水平更好地诊断菌群的代谢活性。

SIP原理是利用稳定同位素（13C或15N）标记代谢物，通过一系列分离获得被标记分子，如微生物膜磷脂和rDNA（或rRNA）。除了用于互营氧化菌的鉴定外，还可以对外源微生物的定植和代谢进行分析。如利用13C标记纤维素，发现瘤胃水解菌无法和市政发酵污泥菌群竞争，从反应器中消失[139]。同样用13C标记纤维素，Li等[140]检测到Acetivibrio是参与纤维素水解的主要菌属。

q-PCR通过检测荧光的循环数（Ct），来定量样品中特定基因的拷贝数。由于产甲烷活性受环境条件影响显著[141]，因此定量分析甲烷菌数量及活性是研究体系微生物机理的有效手段。首先，不同的环境条件有特定的甲烷菌类型，如氨氮浓度的升高，水力停留时间的缩短、乙酸浓度的增加等环境因素使Methanosaeta产甲烷活性减低，适应能力强的Methanosarcina种属成为优势菌群[76]。而当OLR过载时，VFAs浓度升高，会导致互营氧化伴生菌（如Methanospirillum hungatei、Methanoculleus receptaculi）取代Methanosarcina成为主导类型[100]。Munk和Lebuhn[142]在中温青贮玉米发酵的研究中，发现甲烷菌及转录活性的变化比TVFA/TIC指标预警反应器酸化提早了一个月。在稳定阶段，嗜氢型Methanoculleus sp.是主要甲烷菌类型；在酸化阶段，适应性更强的Methanosarcina sp.成为主要产甲烷类型。其次，不同的温度条件决定了甲烷菌类型的变化[9]。如Lee等[105]发现高温优势甲烷菌为Methanoculleus，但pH升高，Methanothermobacter成为主要菌属；而中温条件下，嗜乙酸型Methanosaeta是主要类型。再者铁（Fe）、镍（Ni）、钴（Co）等金属是产甲烷过程的重要辅因子，影响甲烷菌的类型和活性，金属元素的缺乏被认为是秸秆沼气反应器运行不稳定的重要原因之一[143]。如Fermoso等[144]在分析Co缺乏条件下甲醇厌氧发酵的研究中，发现Co缺乏使产乙酸比嗜甲醇型产甲烷代谢更有热力学优势，在10d内污泥中Methanosarcina消失，产甲烷活性减少，最终导致反应器酸化。Gustavsson等[145]在富硫酒糟厌氧发酵时，发现甲烷菌群结构受Ni和Co可利用态浓度影响，可以作为体系运行的监控指标。当Ni和Co投加时，Methanosarcinales占主导地位，当Ni和Co缺乏时，VFAs浓度增加，Methanomicrobiales丰度升高。