3.1　抗性淀粉的来源、分类和结构

3.1.1　抗性淀粉的来源和分类

抗性淀粉的抗酶解性是由于其内部的双螺旋在较强的氢键及范德华力作用下形成晶体结构，该结构降低了抗性淀粉的易损性表面积，有效阻止酶靠近淀粉的D-葡萄糖苷键，从而减少淀粉酶活性基团与淀粉分子结合的机会。2009年国际官方分析化学家协会（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）将抗性淀粉划归为膳食纤维。依据抗性淀粉的来源和特殊的酶抗机制可细分为物理包埋淀粉RS1、抗性淀粉颗粒RS2、回生淀粉RS3、化学改性淀粉RS4、直链淀粉-脂质复合物RS5。表3-1是常见食品中的RS含量。

RS1，即物理包埋淀粉（physically inaccessible starch），RS1淀粉在谷物和种子的胚乳中合成，淀粉颗粒被蛋白质和细胞壁包裹，这种物理结构阻碍了淀粉消化，从而降低了生糖反应。当淀粉以全谷物的形式进行蒸煮时，豆科植物种子的细胞壁和谷物的蛋白质阻碍水分渗入淀粉，淀粉无法得到充足的水分进行膨胀和糊化，因此不易与淀粉酶结合发生水解作用。此外，细胞壁和蛋白质作为一种物理屏障，也阻止消化酶的靠近和水解，使得部分淀粉不能在小肠内被消化吸收而进入结肠，这类淀粉被称作RS1。RS1主要存在于全部或部分碾磨的谷物、种子、根茎和豆类中。加工时的粉碎、碾磨及饮用时的咀嚼等物理动作可改变其含量。RS1具有酶抗作用是由于酶分子很难与淀粉颗粒接近，并不是由于淀粉本身具有酶抗性能。抵抗酶结能力弱，可在小肠中缓慢降解，仅部分可被消化吸收。在正常蒸煮条件下，RS1具有热稳定性，因此可以将其广泛应用到传统食品中。

RS2，即抗性淀粉颗粒（resistant granules）或生淀粉，主要存在于水分含量较低的天然淀粉颗粒中，如高直链玉米淀粉、生马铃薯和绿香蕉，它们都含有B型或C型结晶包埋结构，紧密排列的分子结构使消化酶无法接近淀粉从而使RS2具有抗性，因此，蒸煮、粉碎等加工方式会提高消化酶的作用效能从而使抗性淀粉含量降低。经过蒸煮，大部分淀粉经糊化作用会失去B型和C型结晶结构，成为快消化淀粉，如烤马铃薯和熟香蕉。然而，高直链淀粉能够产生大量的直链淀粉和支链淀粉的长链，即使经过高温蒸煮其结晶结构也不易被破坏，这种淀粉的糊化温度高于水的沸点，因此在蒸煮的过程中，淀粉的晶体结构不发生改变，依然保持抗消化酶水解的特性。

RS3，即老化回生淀粉（retrograded starch），这一类淀粉是由食品加工过程中发生回生作用而形成的，如冷却的马铃薯和回生的高直链玉米淀粉等。淀粉类食物在冷冻条件下，淀粉会发生回生作用，在回生过程中直链淀粉分子和支链淀粉的长链缠绕在一起形成双螺旋结构，不易与淀粉酶结合，因此使淀粉具有抗消化特性。RS1和RS2是天然淀粉，一般情况下，食品的加工过程（如挤压、蒸煮等）都会破坏RS1和RS2的结构，但水分含量高时，直链淀粉分子内部氢键作用加强，更容易回生形成RS3，即RS3淀粉是在加热冷却过程中形成的。RS3包括RS3a和RS3b两种，其中RS3a为凝沉的支链淀粉，RS3b为凝沉的直链淀粉。RS3b的抗酶解性更强，而RS3a经过再加热可被淀粉酶降解。RS3溶解于氢氧化钾溶液或二甲基亚砜（DMSO）后，能被淀粉酶水解，是一种物理变性淀粉。由于回生淀粉熔点是155℃，因此RS3淀粉很稳定。RS3是一种可溶的膳食纤维，不仅具有热稳定性，还具有较高的持水能力，使其在传统食品的加工中具有更加广泛的应用价值。尤其当它被作为一种原料添加在熟食制品中时，能保留抗性淀粉原有的营养功能特性。RS3具有较高的商业价值，国内外对其研究最多。

在直链淀粉水溶液中形成RS3的机制有两种假说：胶束模式（micelle model）和层状模式（lamella model）。如图3-1所示，前者主要是直链淀粉在重新形成有序结构的过程中，通过彼此间相互作用使双螺旋在链的一个特定区域上排列成晶体结构（crystalline structure，C），其间散布着无定形的酶降解区域。后者主要是直链淀粉分子在聚集形成双螺旋结构时，发生了淀粉分子链的折叠，形成二维层状的紧密结构，其中褶皱带是无定形的（amorphous，A），而层状的中心是结晶的（crystalline，C）。

RS4，即化学改性淀粉（chemically modified starch），主要由植物基因改造或用化学方法改变淀粉分子结构所产生，主要的修饰手段有醚化、酯化和交联作用等，从而获得具有淀粉酶抗性的淀粉。其中酯化作用和醚化作用改变了淀粉的结构，阻碍了消化酶的水解，从而使淀粉具有抗消化特性；交联作用使淀粉失去了膨胀能力，在蒸煮过程中依然保持颗粒状态，不易被淀粉酶水解和微生物发酵，从而使淀粉具有抗消化特性。常见的RS4有辛烯基琥珀酸淀粉、羧甲基淀粉、乙酰基淀粉、羟丙基淀粉、热变性淀粉以及淀粉磷酸酯、淀粉柠檬酸酯等。RS4常用于面包、曲奇饼干等糕点类食品的工业化生产。它也是抗性淀粉商品的另一重要来源，是抗性淀粉研究中新的生长点。

RS5，即直链淀粉-脂质复合物（amylose-lipid complexes），是指当淀粉与脂质之间发生相互作用时，直链淀粉和支链淀粉的长链部分与脂肪醇或脂肪酸结合形成的复合物。当线性的淀粉链与脂质复合物形成螺旋结构时，脂质存在于双螺旋的大沟和小沟中，使得直链淀粉的结构发生改变，由平面螺旋变成了三维螺旋，这种复合物不溶于水，且具有热稳定性特性，不易与淀粉酶结合。淀粉-脂质复合物具有消化酶抗性主要有两个原因：①淀粉-脂类复合物的结构与支链淀粉分子缠绕在一起，阻碍了淀粉颗粒的膨胀，淀粉酶不能进入淀粉颗粒内部，不易将其水解；②淀粉-脂质复合物比直链淀粉具有更强的消化酶抗性。其中直链淀粉-硬脂酸复合物是一种典型的RS5，研究证实淀粉颗粒中直链淀粉-硬脂酸复合物的形成限制了淀粉的膨胀，并且硬脂酸包裹在淀粉颗粒表面进一步增强了RS5的酶抗性。这种抗性淀粉糊化温度更高，热稳定性更强，也更容易发生回生作用，而且在95～100℃条件下酶解后依然保持半晶体结构。使用脱分支的高直链玉米淀粉和自由脂肪酸形成的单螺旋复合物来制备RS5，抗性淀粉的含量最高可达75%。有研究将RS5定义为由不溶于水的线性聚α-1，4-D-葡萄糖形成的多糖，这种多糖不能被α-淀粉酶降解，并且聚α-1，4-D-葡萄糖可以促进结肠内短链脂肪酸的形成。因此，RS5可以作为预防结肠癌的营养补充剂。

3.1.2　抗性淀粉的结构

3.1.2.1　抗性淀粉颗粒表面结构

植物体中淀粉常以颗粒形式存在，不同来源的淀粉形状各异，在显微镜下观察淀粉颗粒的形状一般为圆形、卵形或多边形。淀粉颗粒在糊化时受到破坏，直链淀粉溶出，并在低温老化过程中形成双螺旋结构，使颗粒结构发生巨大变化，导致原淀粉颗粒形状消失，形成不规则的粗糙颗粒结构。不同来源淀粉颗粒形状均有显著差异，但抗性淀粉颗粒均呈现为不规则形状，表面很粗糙，是一种近似蜂窝状的纤维网络结构。

研究发现，玉米淀粉颗粒表面光滑，呈不规则多边形，直径约20μm，表面无明显缺陷或损坏迹象；但经淀粉酶处理后，颗粒黏合在一起，形成一种粗的、类似蜂窝状网络结构的抗性淀粉，这种网络结构系由直链淀粉和支链淀粉所构成。淀粉凝沉过程中，游离直链淀粉链成螺旋状，可使淀粉结构重组，形成致密结晶结构，增强对酶的抵抗性。

经酶脱支法制备的大米抗性淀粉颗粒失去了原淀粉的颗粒形态，表面粗糙，不规则的微粒相互黏附形成蜂窝状纤维网络结构。采用环境扫描电镜（environment scanning electron microscopy，ESEM）观察压热法制备的莲子抗性淀粉颗粒表面结构，结果显示经糊化和老化处理后，原淀粉规则的椭圆形状消失，形成致密的块状结构，抗性淀粉表面展现为鳞片和沟壑状，而不同制备工艺对抗性淀粉颗粒表面和晶体结构有不同的影响。研究也发现抗性淀粉颗粒表面形态不同主要与回生阶段参与重结晶的直链淀粉数量有关。

3.1.2.2　抗性淀粉分子和晶体结构

淀粉作为一类天然多晶聚合物，其颗粒由直链和支链淀粉两种主要组分组成。抗性淀粉是淀粉经改性制备而成的，其颗粒结构主要由结晶区和非结晶区交替构成。多晶体系中还存在着介于结晶和非晶之间的亚微晶结构，该结构被认为是由结晶、亚微晶和非晶中的一种或多种结构形成的。晶体性质和结晶结构等结构特性直接影响着抗性淀粉的功能特性。因此，明确抗性淀粉分子、晶体结构、物理化学性质以及淀粉生成的机制，对提高抗性淀粉品质和应用功效，进而推进淀粉工业的发展具有极其重要的意义。

目前国内外学者普遍采用红外光谱、核磁共振波谱、X射线衍射等技术研究淀粉分子和晶体类型及结构变化。红外光谱（infrared spectra，IR）技术对物质分子的结构研究是通过检测分子转动和内部原子间相对振动来完成的。淀粉的红外特征峰对淀粉结晶、分子链构象以及螺旋结构的变化十分敏感，可用于检测淀粉分子的结晶结构和分析变化规律。通过偏最小二乘法（partial least square，PLS）和联合区间偏最小二乘法（synergy interval partial least square，SiPLS）建立的莲藕淀粉含量的近红外光谱分析模型，实现了莲藕淀粉含量的无损检测。有研究采用二维相关红外光谱技术的指纹鉴定方法分析了6种不同植物来源的淀粉在外部微扰作用下的变化，实现不同种类、产地、品种淀粉谱图区分，为分析复杂高分子化合物提供了一种新的方法和手段。

核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）是利用某些带有磁性的原子核在外加直流磁场作用下吸收能量，产生原子核能级间的跃迁，通过纵向弛豫、横向弛豫及自旋回波和自由感应衰减等参数研究高分子结构和性质。随着横向极化和磁角度旋转技术的发展，核磁共振固相波谱的灵敏度得到了很大提高，目前核磁共振技术兼具检测速度快、精度高、重现性好等一系列特点，已被广泛应用于淀粉及其衍生物的分子和晶体检测。有研究利用单脉冲-魔角旋转技术研究小麦淀粉颗粒的结构，显示小麦淀粉颗粒中直链淀粉-脂肪络合物的质子旋转弛豫时间明显短于结晶淀粉，小麦淀粉颗粒是由双螺旋淀粉链形成的高度结晶区域、直链淀粉-脂肪复合物构成的类似固态物质的区域和完全的无定形区域这三种不同的组分构成的。在比较直链淀粉含量为0～84%的玉米淀粉在不同水分含量下核磁共振的化学位移、相对共振强度、谱线宽度和波谱形状的差异时，发现当淀粉水合到30%左右时，直链淀粉的含量明显地影响核磁共振的相对信号强度和谱线宽度，推测水合作用后结晶度的增加和无定形组分信号的缺失是核磁共振谱线宽度变窄的原因。此外，用17O NMR技术研究淀粉／水的比率、直链淀粉含量、磷酸化程度以及碘化钾对淀粉糊化的影响，发现淀粉糊化时自旋-自旋弛豫时间T2发生明显变化，说明在糊化时高含量的直链淀粉导致水分子的流动性降低，高度磷酸化导致水流动性降低，伴随糊化温度的下降，加入碘化钾可以有效地降低水的流动性和糊化温度。

晶体能对X射线产生衍射效应，利用这种衍射可以测定晶态物质在原子水平上的结构。淀粉结晶结构X射线衍射图样呈尖峰衍射特征，而非晶和亚结晶结构呈弥散峰衍射特征。研究发现，抗性淀粉颗粒是部分结晶体，有结晶区和无定型区。X射线衍射表明，抗性淀粉晶体在空间上形成双螺旋结构，主要有四种，A型、B型、C型和V型，回生温度对晶体结构会造成影响，低温会导致B型结构形成，而高温会导致A型结构形成。不同来源的淀粉X射线衍射图样存在一定的差别，大麦、小麦、燕麦、玉米等谷类淀粉产生A型X射线衍射图谱，马铃薯、木薯等块茎类淀粉产生B型衍射图谱，而绿豆、豌豆、扁豆、蚕豆等豆类和块根类产生C型衍射图谱。研究不同超高压条件处理对莲子淀粉晶型结构的影响，发现莲子淀粉经超高压处理后颗粒特性发生明显变化，X射线衍射图谱由C型向B型转变。

Eerlingen等分离的抗性淀粉的衍射图谱显示B型晶体结构；13C NMR结果进一步证明抗性淀粉晶体是来源于直链淀粉的结晶。差示扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）研究也发现抗性淀粉晶体主要是由直链淀粉的结晶形成，因为在120～165℃之间有一吸热高峰，这一温度范围是直链淀粉晶体的熔解温度，而支链淀粉晶体在60～100℃即熔解。所以用耐热的α-淀粉酶所分离的抗性淀粉只是直链淀粉的结晶。而且还发现抗性淀粉的焓变值随其产量的提高而增大。有学者通过对高直链淀粉玉米淀粉、小麦淀粉、玉米粉按给定步骤形成的RS3的同质多晶型的研究发现，40℃时老化形成B型结晶，而在95℃老化则形成A型与V型结晶的混合物。差示扫描量热分析未显示多晶型间熔点有重要差异，T_m为140～170℃。有研究者水解玉米抗性淀粉时发现，玉米淀粉和RS4为A型结晶体，而RS3为B型结晶体。淀粉结晶度要小于RS3结晶度，且相同制备方法得到抗性淀粉结晶度与其晶体结构和含量有关。晶体类型仅基于不同粒度，与密度和硬度无关。新结晶结构的出现，也能限制淀粉酶水解。研究发现，经淀粉酶处理淀粉，抗性淀粉结晶度显著增加，且结晶度越大，抗性淀粉含量越高。另外，研究还发现，不仅直链淀粉可重结晶，且被脱支支链淀粉会利于抗性淀粉在加热冷却过程中晶体结构形成。抗性淀粉抗淀粉酶水解的能力来源于直链淀粉结晶，直链淀粉在加热、冷却和贮藏过程中部分分子相互靠近，通过氢键形成双螺旋，双螺旋再相互叠加形成直链淀粉结晶。抗性淀粉也含有少量的支链淀粉、脂类和蛋白质。

但聚合度为多少的直链淀粉易于结晶参与抗性淀粉的形成又是一个很重要的研究课题。国外主要用还原末端法、凝胶渗透色谱、高效离子交换色谱和高效排阻色谱法测定抗性淀粉的分子量分布，并且单一的测定方法存在较大的误差，人们逐渐倾向于采用多种方法相结合来测定。一般认为平均聚合度DP_n范围在30～200。杨光等用还原末端法测得抗性淀粉的平均聚合度为50，平均分子量为8100，然后以此为依据，在一个相对小的分子量范围内为高效排阻色谱选择分子量标样，最后得出抗性淀粉的分子量范围绝大多数在6300～35000之间，平均分子量为12681，并得到了分子量分布曲线。Gidley等认为聚合度必须在10～100之间才能形成双螺旋。Eerlingen等研究发现，用β-淀粉酶处理马铃薯直链淀粉，得平均聚合度在40～610之间的片段的溶液（8.3g/L），然后在4℃下老化，用X射线衍射观察发现所分离出来的抗性淀粉是由短链（平均聚合度在19～26）组成。因此可以认为RS3主要是由一些短结晶片段构成。