第四节 基于化学成分相互作用的中药配伍禁忌研究方法
中药配伍禁忌的成因可归纳为两个主要方面，即药物间化学成分的体外相互作用，以及成分在体内与机体间的相互作用。中药方剂大部分均由多味药物组成，主要的给药方式就是汤剂口服。在煎煮的过程中，不同药物间的化学成分在水溶剂的条件下可以发生复杂的相互作用，造成方剂的作用下降或毒性增加，即产生配伍禁忌。进入体内后，这些化学成分可能相互影响彼此的吸收、分布、代谢及排泄（ADME）过程，影响重要有效成分或毒性成分的体内过程，同样会形成配伍禁忌。
一、药物间化学成分的体外相互作用
中药在煎煮的过程中，大量成分进入到水溶液中，使水溶液的理化性质发生变化，同时以水溶液为媒介，这些成分间还会发生一系列复杂的化学反应。多药材合煎与单煎相比，水溶液的性质与成分均不相同，很可能使得更多的毒性成分转移到溶液中，或者由于化学反应的发生产生新的有毒物质，也可能使得原有的有效成分含量降低，这些变化都会导致中药配伍禁忌的发生。
通过体外比较药材合煎与单煎化学成分的变化与差异，可以发现可能导致配伍禁忌的化学成分变化。由于药材中化学成分数量众多，结构复杂，一般可采用液—质联用分析方法，快速获得大量的化学成分信息，结合相对定量方法寻找合煎与单煎方式下发生变化的成分。也可借鉴代谢组学的研究方法，将合煎与单煎方式看作两组样本，借助化学计量学方法比较其成分差异，并快速获得差异成分信息。
以芫花-甘草反药组合为例，采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF／MS）与超高效液相色谱串联三重四级杆质谱（UPLC-TQ／MS）两种液-质联用技术相结合的手段，发挥各自的定性与定量优势，探讨芫花／醋芫花与甘草配伍水煎过程物质相互作用导致化学成分组成的变化及其特点。
芫花与甘草合煎液和两药单煎混合液总离子流图中峰数目基本一致，仅部分峰面积发生改变，表明合煎液与单煎混合液的化学成分基本相似，如图2-7。醋芫花与甘草合煎液和两药单煎混合液的总离子流图与之类似。并且根据已有对照品及文献中芫花、甘草化学成分的报道，依据保留时间、准分子离子的精确质量及MS／MS质谱图中的碎片信息可以确认提取液中的化学成分，借以明确成分的来源。
为探讨芫花与甘草合煎过程中各类化学成分溶出变化规律，可以设计一系列两药不同配比后混合煎提，采用灵敏度更高的UPLC-TQ／MS进行定量分析。将芫花／醋芫花-甘草不同配比供试液中某峰面积与内标物峰面积之比除以该峰来源的药材质量用以表示该成分的溶出率，为保证结果可靠，防止提取溶媒量不同而影响其提取率，此值再除以单味药材相同加水量的供试液中相应成分的溶出率，即为此成分的相对溶出率（RR），如式1表达，以此表示由于合煎引起的化学成分溶出变化，RR＞1，表示促进溶出；RR＜1，表示抑制溶出；RR＝1，表示不影响溶出。
Ax：合煎供试液中某化学成分的峰面积；As：合煎供试液中内标物的峰面积；mx：该峰来源的药材质量；Ax单：单味药材供试液中对应成分的峰面积；As单：单味药材供试液中内标物的峰面积；mx单：单味药材质量。
由研究结果分析探讨芫花与甘草合煎过程中药物相互作用导致化学成分溶出变化特点，芫花／醋芫花-甘草不同配比合煎液中多个化学成分相对溶出率结果显示，其中各成分的溶出存在一定的相互作用且具有一定的规律性。在药典规定的配比范围内随甘草比例升高，芫花不论醋炙与否，其中的二萜类成分和大多数黄酮类成分相对溶出率均呈上升趋势；而芫花对甘草中的皂苷类成分和黄酮类成分相对溶出率影响较小。甘草与芫花合煎过程中，甘草对芫花中的二萜类成分的溶出影响较为显著，尤其对芫花酯甲（yuanhuacine）、芫花酯乙（yuanhuadine）及芫花酯己（yuanhuajine）的溶出影响最为显著。分析其结构特点，瑞香烷型二萜R2为不饱和链烃取代产物易于被转移溶出，且随双键数的增加易于被转移溶出。黄酮类成分是芫花及甘草中的主要成分，也是有效成分，其虽然不是有毒成分，但它可能会对其它类成分的吸收、分布及代谢有影响，研究该类成分在合煎过程中的变化规律有助于探讨两药合用相反机制。
由此推测芫花中二萜类毒性成分溶出增加是芫花与甘草配伍禁忌的可能机制之一，前期研究结果表明，芫花中含有的二萜类成分是其主要毒性成分，甘草中的皂苷类成分具有表面活性作用，对脂溶性成分有一定的增溶作用。本研究结果证实，芫花不论醋炙与否，芫花与甘草合煎，甘草能促进芫花中二萜类毒性成分溶出率提高，导致两药合煎毒性显著增加，从药物相互作用的角度揭示了芫花与甘草配伍禁忌的可能机制。
由此认为中药合煎过程理化性质变化与毒效关联分析，可探讨反药组合禁忌机制。中药配伍在煎煮过程中由于各类型成分间的相互作用可影响其化学成分的转移溶出，导致汤液组成及其理化性质改变，造成毒效变化，影响临床用药的有效性与安全性。因此，从中药合煎过程理化性质变化与毒效关联的角度探讨和评价中药配伍禁忌反药组合致毒增毒或减效降效等机制具有重要意义。
二、基于药物体内过程的中药配伍禁忌研究方法
中药配伍禁忌除配伍药味在药液制备过程中复杂的化学物质相互作用可能产生新的致毒成分，或是促进毒性成分溶出率提高而增毒外；也包括药液进入机体后，在吸收、分布、代谢和排泄过程中，原形药物成分间或经与体内生物修饰物及其代谢产物成分间相互作用产生毒性，或是增加外源性毒性物质生物利用度的提高等。
基于药物体内过程的中药配伍禁忌研究技术方法体系
药物经口服后在胃肠道吸收过程中需要转运蛋白的参与。已发现的转运蛋白有：多药耐药蛋白（MDR）、多药耐药相关蛋白（MRP）、有机阴离子转运蛋白（OAT）、有机阳离子转运蛋白（OCT）和寡肽转运蛋白（PEPT）等。在这些转运蛋白中，MDR中的P-糖蛋白（P-gp）广泛存在于肠壁、胆管、肾小管、血脑屏障和肿瘤组织中，能将药物从细胞内主动转运到细胞外，参与药物的吸收和靶组织转运。当某一化学成分影响了P-gp的活性，则能改变另一种药物或成分的吸收速率及吸收程度，并最终影响其血药浓度。
基于药物吸收过程建立以下技术方法体系：
（1）建立小肠单次灌流、肠道血管灌流等生物模型，利用现代分析手段（LC-MS联用技术、同位素示踪技术等）进行定性分析与定量评价，研究药物吸收转运过程，探讨中药多成分在吸收时药物-药物、药物-机体间的相互作用关系。
（2）建立扩散池法、翻转肠囊法等离体模型和Caco-2，MDCK等细胞模型，分析中药各成分对外排蛋白（P-gp，Mrp2，Bcrp）的作用，评价中药多成分配伍后对吸收的相互影响（图2-8）。
药物从给药部位需经过多个生物膜才能到达靶组织和作用位点。机体的屏障组织如血脑屏障、胎盘屏障、血睾屏障等分布的P-gp将外源性化合物外排至细胞外，并改变药物在局部组织的分布。调节这些组织中P-gp的活性，将影响药物在特定组织的靶向性分布。
中药配伍后若产生不同的器官毒性，如肝毒性、肾毒性、心脏毒性、神经毒性等，表明各药配伍后其毒性成分在各器官分布特点不同。基于药物分布过程建立以下技术方法体系：
利用Caco-2，MDCK细胞及PAMPA人工膜，评价中药各成分跨膜转运特点。
近年微透析技术的发展对中国传统医学的现代化同样提供了一条新的研究途径。微透析技术也为药物代谢动力学研究提供了巨大的帮助。吸收、分布、代谢、排泄（ADME）一直是药代动力学工作者研究的内容，以往的研究一般是以收集体液（血液、尿液等）和采取组织匀浆的方法来研究ADME。这是一种“非实时方法”，所得到的数据比较间接、粗糙，且对实验动物损伤大。而微透析技术给研究者带来了极大的帮助。微透析是一种在线、连续的取样手段，微透析技术不同于以往传统的研究手段，它可以实现实时、在线取样，实时监测生物体内各种内源性和外源性物质变化。药物的组织分布是影响药物作用的一个重要因素。药物在组织中浓度与药物作用直接相关。因此，如何评价药物组织分布和靶器官的药物动力学参数也是至关重要的。然而，以前缺少可以直接评价各组织药物浓度的方法，因此，药代动力学研究局限于那些相对比较容易获得的生物样本中，比如尿液、唾液等。最近几年，微透析技术的出现为评价药物组织分布和靶器官的药物动力学参数提供了方法学的帮助。
在中药配伍禁忌研究中，微透析技术的特点在于：①可以在更短的时间间隔内收集样品，因此可以在自由活动的动物身上进行连续采样；②可以在同一动物上进行多部位采样，从而可以进行药物的组织分布研究。这样可以大大减少动物使用数量。比如要用常规方法进行药物的组织分布研究，进行8个时间点采样，每个时间点需要处死6只动物，那总共需要处死48只动物。而采用微透析取样，只需要6只动物就可以进行19个时间点的采样。这样，微透析取样可以使用更少的动物数而获得更多更加准确数据。由于微渗析探针膜的分离作用，大分子的机体内源性物质不能进入渗析液，样品相对纯净，不需要繁琐的样品前处理工作，可实现与HPLC-DAD／ELSD、UPLC-TOF／MS等仪器联用进行在线进样分析，从而反映药物体内的真实变化。
将微透析探针包埋于血管、肝脏、肾脏、脑组织等各器官，结合毒理学评价，分析毒性靶器官与非毒性靶器官中成分的差别，确定中药配伍禁忌物质基础及其作用途径（图2-9）。
药物体内代谢包括Ⅰ相和Ⅱ相两类反应。Ⅰ相反应催化氧化还原反应，涉及细胞色素P450（CYP）酶家族；Ⅱ相反应催化结合反应，涉及葡醛酸转移酶（UGT）、硫酸转移酶（SULT）、乙酰化酶、谷胱甘肽转移酶（GST）等。
中药成分对以上代谢酶具有诱导或抑制作用，可能会引起配伍致毒增毒、减效。为探讨中药配伍对药物代谢过程的影响，应建立相应技术方法体系。
（1）建立多成分同步检测技术，在整体动物水平探讨中药多成分体内动力学及PK-PD过程。
（2）建立肝微粒体代谢、肝细胞代谢、肠道菌群代谢、肠微粒体代谢方法，研究中药多成分对各代谢酶的作用，探讨配伍应用时可能引起的相互作用（图2-10）。
可采用技术包括：高效液相-飞行时间质谱（UPLC-QTOF），同步进行多级碎裂和精确质量测定，对生物样品中微量药物及超微量药物进行高通量、高灵敏度的定性分析；高效液相-三重四级杆串联质谱（UPLC-TQ），对生物样品中微量药物及超微量药物进行高通量、高灵敏度的定量分析。
药物以原形或代谢产物的形式经胆汁、尿液、粪便排出体外的过程中，分布于肝、肾和肠腔等组织上皮细胞的P-gp能加快药物的清除，如果影响这些组织的P-gp，则能改变药物的消除速度。中药配伍使用后会作用于以上排泄相关蛋白，影响其多种成分的排泄过程，可能产生体内药物蓄积并导致毒性反应。因此，基于药物排泄过程建立系列技术方法体系（图2-11），研究中药配伍对P-gp及其它药物排泄相关蛋白的影响及药物间相互作用，分析中药多成分配伍后在排泄过程中相互影响，是寻找导致配伍禁忌的可能途径。
代谢组学研究通过分析生物体处于不同发育阶段或不同生长环境中的化合物，跟踪其代谢路径，以描绘出基因、蛋白和代谢产物之间各种复杂的相互作用，全面系统研究代谢产物的变化规律。可借鉴代谢组学研究思路，应用LC-MS、GC-MS及NMR等高通量、高分辨、高灵敏度的现代分析仪器，定性定量研究生物体体液中的内源性代谢产物，结合模式识别等化学信息学技术，分析生物体给予中药前后代谢指纹图谱的差异，获得相应的生物标志物群，确定药物毒性的特征代谢模式及其生物标志物，从全新的角度探究中药配伍禁忌科学内涵。
随着中药代谢新技术、新方法的不断发展和药物代谢组学的出现，基于药物体内代谢过程进行中药配伍禁忌研究，将为中药复杂体系的研究提供新的策略和方法。
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