二、各类聚合物修饰蛋白

（一）聚乙二醇修饰蛋白质类药物

聚乙二醇（PEG）是一种线形或带分支的中性聚合物，通常呈电中性，易溶于水和多种有机溶剂。在水溶液中，PEG以高度水合形式存在，每个乙氧基单元可以紧密结合一个分子水。为避免PEG分子在蛋白质修饰过程中发生分子自身及分子间的交联和团聚，通常采用一端钝化处理的甲氧基聚乙二醇（methoxy polyethylene glycol，mPEG）来修饰蛋白质分子，其化学通式见图13-13。

PEG修饰蛋白质的研究兴起于20世纪70年代后期，1977年Abuchowski等最先发明了蛋白质的PEG化，PEG与牛血清蛋白的反应是PEG修饰蛋白质的第一个例子，同时证明了PEG修饰的蛋白质类药物比未修饰的有更好的疗效。1990年，第一个PEG化的蛋白质类药物被FDA批准用于临床——可用于治疗重度联合免疫缺陷综合征（severe combined immunodeficiency disease，SCID）的PEG-腺苷脱氨酶，商品名为Adagen。化学修饰剂与蛋白质的反应主要有酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、芳香环取代反应等。有代表性的修饰剂有乙酰咪唑、卤代乙酸、N-乙基马来酰亚胺、碳化二亚胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、N-卤代琥珀酰亚胺、羧甲基纤维素、多聚唾液酸、聚氨基酸、葡聚糖、聚乙二醇等。与其他修饰剂相比，聚乙二醇类修饰剂毒性小、无抗原性、具有良好的两亲性，且生物相容性已经得到FDA的认证，是应用最多的一类修饰剂。聚乙二醇（PEG）修饰技术，又称PEG化，是一项利用聚乙二醇衍生物对蛋白质进行修饰的技术。目前，美国FDA已批准了5个PEG化的蛋白质药物，同时国外还有28种PEG化的蛋白质药物正处于不同的临床试验期。PEG为一种亲水、不带电荷的线性大分子，当其与蛋白质的非必需基团共价结合时，可作为一种屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇，避免抗体的产生，或者阻止抗原与抗体的结合而抑制免疫反应的发生。蛋白质经PEG修饰后，相对分子量增加，肾小球的滤过减少；PEG的屏障作用保护了蛋白质不易被蛋白酶水解，同时减少了抗体的产生，这些均有助于蛋白质类药物循环半衰期的延长，从而达到提高药效、减少用药次数的目的。

1977年，Abuchowski等证明，修饰后蛋白比未修饰蛋白更加有效。普遍认为，经PEG修饰后，大多数蛋白质的性质会发生以下变化：①免疫原性与抗原性降低；②循环半衰期延长；③溶解性增加；④耐蛋白酶水解；⑤生物利用度提高；⑥毒性降低；⑦热稳定性及机械稳定性增加；⑧等电点、电泳行为、动力学性质等改变。另外，修饰作用还体现在体内活性提高而体外活性降低。一般与PEG耦合的大分子，与未修饰的分子相比，其物理与化学性质会发生改变，如构象、空间位阻、静电结合性质、疏水性等。与受体连接的亲和力经常受到这些物理、化学性质变化的影响而降低。而修饰后蛋白在生物体内循环半衰期延长这一特性在体外活性检测时不能被体现，故而修饰后蛋白体外活性降低。

PEG为一种无色透明的液体，常温下，PEG相对分子质量小于 1 000时为液体，分子质量大于1 000时呈米白色糊状或固体，微有异臭，易溶于有机溶剂，有较强吸湿性，对人体无毒副作用，因此可用PEG来修饰蛋白质类药物，以改善蛋白质类药物的性质，使其效果更好。PEG主要从以下几个方面提高蛋白质药物的药效：①PEG修饰的蛋白质分子质量增大，肾清除率降低，半衰期延长；②PEG能够掩盖蛋白质表面的抗原识别位点，降低免疫原性；③PEG水溶性较好，提高蛋白质药物在水溶液中的溶解度；④PEG在蛋白质表面起到屏蔽和位阻效应，降低蛋白酶的水解作用，提高稳定性。传统的PEG修饰主要是对蛋白质中的赖氨酸残基进行修饰，但由于蛋白质中赖氨酸残基数目较多，因此修饰位点也较多，这就会造成修饰产物的不均一性以及低生物活性，同时也使修饰产物的分离纯化更困难。通过蛋白质定点修饰可以避免随机修饰的盲目性，这样既不影响蛋白质活性中心的结构，又能选择性地使PEG修饰剂与蛋白质中特定部位进行连接。

1.针对蛋白质中氨基末端（—NH₂）的定点修饰

蛋白质中可以被定点修饰的氨基（—NH₂）主要是蛋白质N端的α-氨基（α-NH₂）和赖氨酸的ε-氨基（ε-NH₂），通常蛋白质N端的α-NH₂的等电点（pKa）为 7.6～8.0，赖氨酸的 ε-NH₂的等电点为10.0～10.2。因此，可以通过控制溶液pH来对蛋白质N端的α-NH₂进行修饰，常用的修饰剂为醛基化 PEG 试剂（mPEG），如 mPEG-丙醛、mPEG-丁醛等。Huang等利用丙醛对重组人成纤维细胞生长因子-2（rhFGF-2）进行修饰（图13-14）。 将溶解于硼酸钠溶液中的rhFGF-2结合到肝素-琼脂糖柱中，然后将mPEG-丙醛溶液作为流动相流过肝素-琼脂糖柱，最后用硼酸钠缓冲液洗脱未反应的mPEG-丙醛，用含2mol/L氯化钠的硼酸钠溶液洗脱PEG-rhFGF-2，再经脱盐等纯化 PEG-rhFGF-2，结果表明，PEG-rhFGF-2在生物体内的免疫原性降低了50%。

还可以利用基因工程对蛋白质N端氨基进行修饰，Yoshioka等利用基因突变技术实现了对肿瘤坏死因子 2-α（tumor necrosis factor 2-α，TNF2-α）的定点修饰，他们从噬菌体文库中选取原TNF2-α中赖氨酸 （Lys11、 Lys65、 Lys90、 Lys98、 Lys112、Lys128）分别被甲硫氨酸 11（Met11）、丝氨酸 65（Ser65）、脯氨酸 90（Pro90）、精氨酸 98（Arg98）、天冬酰胺 112（Asn112）、脯氨酸 128（Pro128）替换的突变体TNF2-α，然后用mPEG-NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）、分支状PEG修饰蛋白质N端氨基进行修饰，修饰产物纯度较高，细胞实验表明修饰产物的活性相对也较高。

在一些蛋白质中，N端—NH₂为其活性中心的组成部分，这时就不能对蛋白质N端—NH₂进行修饰，Youn等研究出了一种定点修饰赖氨酸 ε-NH₂的策略（图13-15），他们用9-芴甲氧羰基（FMOC）作为保护剂，使鲑降钙素中的N端—NH₂和赖氨酸ε-NH₂被修饰，只保留 Lys18的 ε-NH₂，然后将PEG-琥珀酰亚胺丙酸盐（SP-mPEG）加入反应物中，进行修饰反应。修饰反应完成以后向修饰产物中加入哌啶，使FMOC从修饰产物中脱离，20分钟后用去离子水或含三氟醋酸的乙腈加入到溶液中终止反应。结果表明，PEG-鲑降钙素的活性为鲑降钙素的8.8倍。随后，他们用同样的方法对生长激素释放因子和胰高血糖素样肽进行了修饰，也达到了较好的效果。

2.针对蛋白质中的巯基进行定点修饰

蛋白质中所含半胱氨酸残基数目较少，多形成二硫键，这就为定点修饰提供了便利。常用的针对巯基的PEG修饰剂有 PEG-马来酰亚胺、PEG-邻-吡啶-二硫醚、PEG-乙烯基砜、PEG-碘乙酰胺等。

（1）对蛋白质中原有的二硫键进行修饰：

在一些蛋白质中，二硫键对于维持蛋白质的活性以及高级结构是必需的，对二硫键进行修饰可能导致其活性丧失、空间结构破坏。Brocchini等研究了一种双烷基化试剂，该试剂对二硫键的修饰反应分两步：①还原剂将二硫键还原为两个硫醇；②双烷基化试剂将硫醇烷基化为三碳桥。PEG通过三碳桥与蛋白质共价耦联。在此方法中，三碳桥（PIT）能够替代二硫键起到稳定修饰产物空间结构的作用，并保持蛋白质的生物活性（图13-16）。Huang等用PIT-PEG对人重组角质细胞生长因子2（rhKGF-2）进行修饰，PIT-PEG与 rhKGF-2以摩尔比9∶1，在25℃、pH 6.2的醋酸盐溶液中反应2小时，用甘氨酸终止反应，反应产物经SDS-PAGE测定，结果显示两条带，一条为rhKGF-2带，另一条为PIT-PEG-rhKGF-2带，表明修饰产物的均一性良好，后续实验表明，修饰后rhKGF-2的活性为未修饰 rhKGF-2的60%，并且修饰后rhKGF-2的热稳定性和结构稳定性都得到了提高，免疫原性降低。

（2）酶催化的定点修饰：

酶催化定点修饰法反应条件温和、酶催化高度专一，修饰能够准确定位在特定位点上，产物均一性好，质量容易控制，是非常有前景的修饰方法之一。

1）转谷氨酰胺酶催化的定点修饰：

谷氨酰胺酶（TGase）是一种蛋白质修饰酶，能催化蛋白质谷氨酰胺残基上的γ-酰胺基团与自由伯胺（蛋白质中常为赖氨酸的ε-氨基）发生酰基转移反应，反应式为 R-CONH₂+R′NH₂——R-CONHR′+NH₃，其中R为含谷氨酰胺残基的蛋白质或多肽，R′为含烷基胺基团的PEG修饰剂。TGase广泛存在于哺乳动物、无脊椎动物、植物、微生物中的组织和体液中，如肝、毛囊、上皮、前列腺、血液等，具有多种生理功能，例如促进细胞分化、肿瘤生长和凋亡等。目前TGase根据来源主要分为两种：来源于豚鼠肝脏的转谷氨酰胺酶（G-TGase）和来源于微生物的转谷氨酰胺酶（M-TGase），在蛋白质的定点修饰中常用的是M-TGase。M-TGase来源于链霉菌属，相对分子质量为37 900，分子中的Cys64对于维持酶的活性是重要的。它可以通过与蛋白质中的谷氨酰胺残基反应，达到蛋白质定点修饰的目的。TGase与蛋白质内谷氨酰胺残基的特异选择性蛋白质或多肽序列的可伸缩性相关，要求酰基供体插入的序列具有高度的构象柔性。Fontana等在M-TGase存在下，用PEG修饰剂与 rIL-2反应，修饰产物相对分子质量为35 000，并且修饰产物的均一性好、活性较高，半衰期为未修饰rIL-2的10倍。

对于仅含一个谷氨酰胺残基的蛋白质，直接用MTGase在缓冲液中反应就可达到定点修饰，但是对于含两个及以上谷氨酰胺残基的蛋白质，直接用M-TGase在缓冲液中进行反应，就会产生异构体，在这种情况下，可以在有机溶剂中进行反应，有机溶剂能够使蛋白质二级结构发生改变，从而减少某些区域的柔性，改变蛋白质构象，使位于柔性区域的谷氨酰胺无法接触到TGase，而不受有机溶剂影响的柔性区域的谷氨酰胺残基可以被 TGase特异性修饰。人生长因子中含有两个谷氨酰胺残基，在体内半衰期较短，Mero等在不同有机溶剂中进行了转谷氨酰胺酶对人生长因子（human growth hormone，hGH）的修饰反应，结果表明，在有机溶剂中得到的修饰产物活性提高。

2）糖基转移酶催化的定点修饰：

在一些微生物中表达的蛋白具有天然的糖基化位点，因此可以利用糖基转移酶对这些蛋白进行定点修饰。其修饰反应由两步组成：第一步，乙酰半乳糖胺在乙酰半乳糖胺（N-acetyl-D-galactosamine，GalNAc）转移酶的催化下连接到蛋白质中丝氨酸或苏氨酸上得到OGalNAc残基；第二步，唾液酸-PEG与 O-GalNAc残基在唾液酸转移酶的催化下进行反应使唾液酸-PEG与O-GalNAc残基相连得到PEG定点修饰产物，该方法已用于粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和干扰素α-2b等的修饰。

3）羧基的定点修饰：

针对羧基的定点修饰常用的修饰剂为mPEG-酰肼（图13-17），反应常在酸性环境中进行，在酸性条件下，蛋白质中的氨基大多呈质子化形式，而不与羧基发生反应，mPEG-酰肼的等电点较低，在酸性条件下可以选择性地与羧基进行耦联。

3.PEG化药物在医学上的运用

（1）应用于肿瘤靶向：

PEG化药物目前仍然主要应用于肿瘤治疗，现在有多种药物正进行后期临床试验。许多研究表明，经过PEG修饰的药物更容易浓集于肿瘤部位而远离正常细胞，这大大增加了强毒性药物或放射性同位素的应用前景。研究人员同时发现，经PEG修饰的免疫球蛋白具有更强的肿瘤渗透能力，循环半衰期也得到改善。一般而言，大多数实体瘤能够提高血管渗透性，小分子药物极易从血管渗漏出去，无法在肿瘤部位达到治疗浓度，只有像多聚体和脂质体这样的大分子能够滞留在肿瘤部位，杀伤肿瘤细胞。这种效应促使了一大批肿瘤药物的出现。在非骨髓来源的恶性肿瘤患者的化疗过程中，化疗药物也会引起髓系粒细胞的抑制作用，因而会出现中性粒细胞减少症，常常会增加临床中性粒细胞减少症相关发热的发病率。Neulasta TM（peg filgrastim）可以刺激抗感染的白细胞（中性粒细胞）的产生，从而降低患者感染的概率。通过PEG的交联，Neulasta在体内的半衰期大大延长，明显减少患者的发热症状，而且减少了频繁注射给患者带来的痛苦。该药已通过美国FDA认证，具有广阔的市场前景。可以预见，PEG化药物的这种特异性靶向能力必将在肿瘤治疗方面发挥更大的作用。

（2）与脂质体联合应用：

脂质体是由一层或多层双分子磷脂膜（每层由水相隔开）所组成的微型球状物，它作为一种新型靶向给药系统，具有无毒、长效等特点，但也存在一些问题，如易被网状内皮系统（RES）所摄取，立体空间不稳定，药物包封率不高，这些都阻碍了脂质体产业化和进一步的发展。Blume等大胆采用PEG单甲醚的磷脂酰乙醇胺衍生物（PEGPE）作为非糖基脂质体取得了较好的结果，从而提出了一个长效脂质体的新类型。各国学者开始对这种PEG交联的脂质体进行广泛的研究，证实了这种新型脂质体在减少RES吸收和提高药物稳定性方面确实有效。O tsubo T制备了传统多柔比星（L-ADM）脂质体和表面被PEG修饰的长循环免疫多柔比星脂质体（34A-PEG-LADM），研究它们对患有侵害性肺曲霉病的小鼠的治疗作用。等量注射这两种药物后发现，小鼠生存率依次为16.7%和100%，1小时后小鼠肺内药物浓度依次为 2.8μg/g和 42.3μg/g，后者约是前者的15倍。药代动力学研究表明PEG的修饰降低了脂质体被RES摄取的概率，大大延长了药物的体内半衰期。其原因可能为：①空间位阻效应，PEG是线形聚合物，缠绕在脂质体表面，形成一个较厚的立体位阻层，这一位阻层阻碍了脂质体与RES的作用；②提高膜表面的亲水性，PEG有很强的极性基团，延长体内半衰期。这两因素同时存在、共同作用。随着研究不断深入，PEG修饰药物与脂质体的交联技术也不断发展，可以预见，在未来的一段时间内还有较大的应用前景。

（3）应用于慢性病治疗：

PEG化蛋白药物在慢性病方面的治疗作用也正越来越受到人们的重视。Nektar公司生产的PEGASYS（PEG耦联干扰素 α-2a）、PEG-INTRON（PEG 耦联干扰素　α-2b）用于治疗慢性丙型肝炎，具有提高生物利用度、低毒、长效等特点，已获FDA许可上市；PEG修饰的1型肿瘤坏死因子受体（P EGsTNF-RI）应用于慢性炎症治疗，其Ⅱ期临床研究表明该药物能够显著减缓类风湿关节炎的关节肿胀和疼痛。可见，PEG修饰的蛋白药物为慢性病治疗架构了一个崭新的平台。

（二）聚丙烯酰胺类聚合物修饰蛋白

聚丙烯酰胺是一种由丙烯酰胺交联聚合得到的高吸水性的聚合物。研究发现，一些化学交联的取代丙烯酰胺类高分子化合物是一种水凝胶，它可在水中溶胀并保持大量水分而同时又不会溶解，并且具有良好的生物相容性，所以药物可以采用包埋或吸附的方法固定在水凝胶中。同时，由于聚丙烯酰胺类聚合物具有温度敏感特性，当温度升高至其最低临界溶解温度时，其体积会突然缩小，发生相分离，利用这一温敏特性可以设计出智能分子开关来释放药物。但是，丙烯酰胺单体具有神经毒性、肾毒性和遗传毒性，并且被认为有一定的致癌性，所以聚丙烯酰胺类聚合物在蛋白质药物的临床应用中值得探讨。

刘铮等以丙烯酰胺使蛋白丙烯酰化，再使用四甲基乙二胺作为引发剂，双丙烯酰胺作为交联剂，来包埋辣根过氧化氢酶（horseradish peroxidase，HRP），发现修饰后的蛋白十分稳定，未修饰的蛋白在高于40℃的条件下就开始失活，而经过包埋的HPR在65℃条件下加热90分钟后还能保持80%的活性。包埋过程见图13-18。

（三）两性离子类聚合物修饰蛋白

近年来，两性离子聚合物被证明具有优异的抗蛋白质非特异性吸附能力，在未稀释血清等复杂环境中显示出了优于PEG的抗蛋白质非特异性吸附能力，使之更能满足蛋白质类药物的实际使用环境，因此有可能取代PEG成为更好的蛋白质修饰材料。两性离子聚合物主要包括磷-铵（磷酰胆碱类，如聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱，pMPC）、磺-铵（磺酸甜菜碱类，如聚磺酸甜菜碱甲基丙烯酸酯，pSBMA）、羧-铵（羧酸甜菜碱类，如聚羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯，pCBMA）三大类两性离子材料。

从20世纪七八十年代起就不断有磷酰胆碱类似物被合成，最早的是在1977年合成的MPC，但是当时的合成效率很低，之后对合成路线进行了改进。Ishihara等将MPC与甲基丙烯酸烷基酯共聚，以所制备的共聚物和醋酸纤维素为原料制备出了MPC血液透析膜，得到的血液透析膜的机械性能良好，并具有高的渗透性，且呈现出阻抗蛋白质吸附特性，血小板黏附和变形也得到了抑制。在我国，袁江等也较早对两性离子聚合物的表面修饰进行了广泛研究。作者与Jiang教授借鉴这些研究结果，系统研究了抗蛋白质非特异性吸附材料纳米水平的结构和化学组成，证明了水分子在材料表面上的紧密结合是形成抗蛋白质非特异性吸附特性的主要原因，而在纳米水平的正负电荷均匀分布、聚合物的舒展结构等首先是为了满足材料表面水合的要求，进而通过其自由度的升高，来进一步降低蛋白质分子在材料表面的吸附。

在上述三种两性离子聚合物中，羧铵类材料羧酸类甜菜碱（图13-19）的应用潜力尤为突出。它是甘氨基酸类似物，细胞毒性很低，具有许多有益的生物特性，能够调节体内的渗透压，还可以作为甲基供体，并能促进脂肪代谢等。一般甜菜碱对体内环境无害，小白鼠皮下注射时致死剂量为18.14g/kg，绝大部分甜菜碱在动物体内被代谢，能够进入蛋白质合成过程，分解时产生的氮对体内环境负荷极其微小。

羧酸类甜菜碱与PEG相比，具有更好的耐生物氧化性和更强的亲水性。羧酸类甜菜碱类聚合物具备了更多的活化基团，通过羧酸类甜菜碱上羧基的活化，可以直接和蛋白质药物上的氨基耦合，而剩余活性中间体能够水解，回到抗蛋白质非特异性吸附状态。同时，由于甜菜碱类聚合物分子本身的两性离子结构，对蛋白质进行修饰后不会影响其表面电荷分布，修饰后的蛋白质分子空间结构不会发生太大的变化，修饰产物的生物活性较PEG修饰产物可能有明显提高。因此，利用甜菜碱类聚合物对蛋白质的修饰方法与PEG相比有更多的材料本身性质和技术上的优势。

目前关于甜菜碱类聚合物修饰蛋白质的研究已证明了这一点。有研究利用相同分子量的羧酸甜菜碱聚合物（pCB）和PEG分别修饰α-胰凝乳蛋白酶（CT），并对修饰产物的生物活性进行检测和对比发现，经过pCB修饰的CT的生物活性高于经PEG修饰的CT。在高温（55℃）条件下变性10分钟后，PEG修饰的CT已完全失去生物活性，而经pCB修饰的 CT仍保有约50%的生物活性。另外，经pCB修饰的CT对底物的亲和性和在5M尿素溶液中的稳定性也都优于经PEG修饰的CT。作者的一些最新研究结果也观察到由两性离子聚合物修饰可以获得活性上升的蛋白质类药物修饰体。这些研究结果均表明，与PEG相比，利用甜菜碱类聚合物对蛋白质类药物进行修饰在材料本身性质和技术上都具有更大的优势，这一方法在今后的蛋白质类药物的研究中具有广泛的应用前景。