第一节　细胞培养基

细胞培养中最重要也是最关键的一步是选择合适的培养基进行体外培养。生长介质或培养基是一种液体或凝胶，旨在支持微生物、细胞或小型植物的生长。细胞培养液通常包括适当的能源和调节细胞周期的化合物。典型的培养基由氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖和血清组成，作为生长因子、激素和附着因子的来源。除了提供营养，培养基还有助于维持pH值和渗透压。动物细胞可以用完全自然的培养基或人工合成的培养基和一些天然产品进行培养，天然培养基完全由自然产生的生物液体组成。天然培养基的主要缺点是由于缺乏对培养基确切组成的了解，其重复性较差。人工合成培养基是通过添加营养素（有机和无机）、维生素、盐、O₂和CO₂气相、血清蛋白质、碳水化合物、辅因子来制备的。不同的人工培养基被设计用于以下一个或多个目的：①即时存活（平衡盐溶液，具有特定的pH和渗透压）；②延长存活时间（平衡盐溶液，补充各种有机化合物和/或血清配方）；③无限生长；④特殊功能。本节主要介绍人工合成培养基。

一、MEM培养基

Minimum Eagle's Medium（MEM）培养基主要应用于贴壁细胞的培养，通过对其配方的调整也可用于其他类型细胞培养，是动物细胞培养最常用的培养基之一。调整盐浓度达到平衡盐的MEM可用于二倍体细胞的培养，不含钙离子的MEM培养基可用于培养悬浮细胞。早期曾尝试培养正常的哺乳动物成纤维细胞和HeLa细胞的某些亚型，发现其需要Eagle基础培养基（BME）所没有的特定营养成分。随后对更多细胞的培养发现，在BME培养基添加特定的营养成分能够帮助更多种类要求苛刻的细胞生长。MEM培养基融合了上述的改良方法，包括更高浓度的氨基酸，使得培养基更接近于哺乳动物细胞的蛋白组分。MEM已被广泛用于培养各种类型的单层培养细胞。选择性地添加非必需氨基酸，联合使用Hanks或Eagles盐溶液，进一步扩大了这种培养基的用途。另外，MEM配方改良也可以选择性地去除钙离子，适合悬浮细胞生长。

二、DMEM培养基

Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培养基的主要特点是含多种氨基酸和葡萄糖，顾名思义是在MEM的基础上研发而来的。与MEM培养基不同，DMEM在增加了各种成分用量的同时又分为高、低糖两种类型。高糖型DMEM有利于细胞快速贴壁且生长较快。

三、F12培养基

F12培养基（Ham's F 12 nutrient medium）是动物细胞培养基，成分复杂，含有多种微量元素，最初设计用于克隆二倍体的中国地鼠卵巢细胞。F12培养基起初是作为一种无血清配方设计的，现在常补加血清用于支持各种正常和转化细胞的增殖。DMEM/F12培养基为两者以1∶1比例配制而成的培养基，是无血清配方培养基开发的主要基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度营养成分的优点。

四、RPMI培养基

RPMI-1640是在Roswell Park Memorial研究所开发，因此缩写为RPMI。该培养基配方基于RPMI-1630系列培养基，使用碳酸氢盐缓冲系统，而且调整氨基酸和维生素用量。RPMI-1640培养基已被用于培养人正常和肿瘤性白细胞，是专为淋巴细胞培养而设计的，现已广泛应用于悬浮细胞的培养。如果适当添加补充剂，RMPI-1640可广泛用于多种细胞类型的培养，包括在72h植物血凝素（PHA）刺激实验中培养新鲜的人类淋巴细胞。

五、199培养基

199培养基最初设计用于鸡胚成纤维细胞的营养研究，含有DL型氨基酸是其特点。现被用于培养各种动物细胞，特别是某些非哺乳动物细胞。许多早期组织培养基主要由动物产品和/或组织提取物配制。1950年，Morgan和他的同事们报道了他们的工作——为细胞培养生产成分完全明确的营养来源培养液。他们的实验采用了经发现利于组织生长、数量可测的不同维生素、氨基酸和其他因子组合，也就是所谓的199培养基。然而，之后发现细胞长期培养需要在培养液中额外补充血清添加剂。适当补充营养物后，199培养基具有更广泛的物种适用性，特别适用于培养未转化的细胞，广泛用于病原学、疫苗生产，以及小鼠胰腺上皮细胞和大鼠晶状体组织的原代外植体体外培养。

六、无血清培养基

无血清培养基是无须加入血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的培养基。许多研究外泌体的实验都会用到无血清培养基。无血清培养基的基本成分是基础培养基及特定添加物。大部分细胞在体外都是以贴壁形式生长，只有少量体内循环细胞是以悬浮形式生长；血清中会含有各种黏附贴壁因子，而当这些贴壁细胞在无血清培养基中生长时，在缺少血清的培养基环境下细胞往往以悬浮形式生长。无血清培养基和试剂已被广泛应用于制备单克隆抗体、病毒抗原和重组蛋白等动物细胞研究中。

绝大部分的无血清培养基内含有转铁蛋白和胰岛素，两者主要用于转运细胞离子以及调节葡萄糖含量，其他的一些蛋白质在细胞培养中发挥各种不同的功能，如抗生物反应器剪切力，提供细胞贴壁所需的基质，作为脂质和其他生长分化因子的载体等。

虽然在研究细胞分泌的外泌体时，无血清培养基是一个很好的选择，但目前血清仍是动物细胞培养中最基本的添加物。当所培养的细胞状态不佳时也可以考虑适当增加血清的浓度，以改善细胞的生长状态，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养基。而当转入无血清培养基培养时，细胞需要一个适应过程，故更换培养基后先不要着急收集细胞，而应该等细胞适应无血清环境后再收集细胞进行实验。同时血清浓度需要逐步降低，从一开始的10%过渡到5%，然后更换为3%再变成1%，最后直至无血清培养。在过渡期间，需要注意在降低过程中观察细胞形态是否发生了变化，是否有细胞死亡增多的现象，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变。

细胞转入无血清培养基之前，建议留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。当然也可以选择去外泌体的血清培养基，但国际认可度不高（表2-1）。