实验六　淀粉酶生产菌发酵培养基的优化

1.实验设计

在工业化发酵生产中，发酵培养基的设计是十分重要的，因为培养基的成分对产物浓度、菌体生长都有重要的影响。实验设计方法发展至今可供人们根据实验需要来选择的余地也很大。

（1）单因素方法　单因素方法的基本原理是保持培养基中其他所有组分的浓度不变，每次只研究一个组分的不同水平对发酵性能的影响。这种策略的优点是简单、容易，结果很明了，培养基组分的个体效应从图表上很明显地看出来，而不需要统计分析。这种策略的主要缺点是：忽略了组分间的交互作用，可能会完全丢失最适宜的条件；不能考察因素的主次关系；当考察的实验因素较多时，需要大量的实验和较长的实验周期。但由于它的容易和方便，单因素方法一直以来都是培养基组分优化的最流行的选择之一。

（2）正交试验设计　正交试验设计就是从“均匀分散、整齐可比”的角度出发，以拉丁方理论和群论为基础，用正交表来安排少量的试验，从多个因素中分析出哪些是主要的，哪些是次要的，以及它们对试验的影响规律，从而找出较优的工艺条件。石炳兴等利用正交试验设计优化了新型抗生素AGPM的发酵培养基，结果在优化后的培养基上单位发酵液的活性比初始培养基提高了18.9倍。正交试验不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式即回归方程，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。而且对于多因素、多水平试验，仍需要做大量的试验，实施起来比较困难。

发酵过程涉及数个工艺参数，每个参数有多个水平，每个因素之间还存在交互作用。采用正交试验设计方法进行多因素、多水平的试验，可以大大减少试验，并确定各因素之间的交互作用。试验次数可以减少为：水平数的平方次。

在多因素试验中，随着试验因素的增多，处理数据呈几何级数增长。例如，2个因素各取3个水平的试验（简称32试验），有32=9个处理；3因素各取3个水平的试验（简称33试验），有33=27个处理；4因素各取3个水平的试验（简称34试验），有34=81个处理……处理数太多，试验规模变大，会给试验带来许多困难。采用正交试验设计，可以大大减少试验次数。

正交试验设计是利用一套规格化的表格——正交表来安排试验，适用于多因素、多水平、试验误差大、周期长等的试验，是效率较高的一种试验设计方法。分组进行多个因素、多个水平的多因素试验，测定试验结果。根据试验设备条件，下面试验（表1-3、表1-4）为3因素3水平试验，正交试验次数为9次，采用L9（34）正交设计表。另外附加一个对照试验CK，共10个试验处理。

表1-3　试验因素水平设计表　　

表1-4　L9（34）正交试验因素设计与结果记录表

（3）均匀设计　均匀设计是我国数学家方开泰等独创的将数论与多元统计相结合而建立起来的一种实验方法。这一成果已在我国许多行业中取得了重大成果。均匀设计最适合于多因素多水平实验，可使实验处理数目减小到最低程度，仅等于因素水平个数。虽然均匀设计节省了大量的实验处理，但仍能反映事物变化的主要规律。

（4）全因子实验设计　在全因子设计中各因素的不同水平间的各种组合都将被实验。全因子的全面性导致需要大量的实验次数。一般利用全因子设计对培养基进行优化实验都为两水平，是能反映因素间交互作用（排斥或协同效应）的最小设计。全因子实验次数的简单算法为（以两因素为例）：两因素设计表示为a×b，第一个因素研究为a个水平，第二个因素为b个水平。Thiel等实验了两个因素：7个菌株在8种培养基上，利用7×8设计（56个不同重复）。Prapulla等实验了三个因素：碳源（糖蜜4%、6%、8%、10%、12%）、氮源（NH4NO3 0g/L、0.13g/L、0.26g/L、0.39g/L、0.52g/L）和接种量（10%、20%），利用5×5×2设计（50个不同重复）。

（5）部分因子设计　当全因子设计所需实验次数实际不可行时部分重复因子设计是一个很好的选择。在培养基优化中经常利用二水平部分因子设计，但也有特殊情况，如Silveira等实验了11种培养基成分，每成分三水平，仅做了27组实验，只是311全因子设计177147组当中的很小一部分。两水平部分因子设计表示为：2n-k，n是因子数目，1/2k是实施全因子设计的分数。这些符号告诉你需要多少次实验。虽然通常部分因子设计没有提供因素的交互作用，但它的效果比单因素实验更好。

（6）Plackett-Burman设计　由Plackett和Burman提出，这类设计是两水平部分因子实验，适用于从众多的考察因素中快速、有效地筛选出最为重要的几个因素，供进一步详细研究用。理论上讲PB实验应该应用在因子存在累加效应，没有交互作用——因子的效应可以被其他因子所提高或削弱的实验上。实际上，倘若因子水平选择恰当，设计可以得到有用的结果。Castro等利用PB实验对培养基中的20种组分仅进行了24次实验，使γ-干扰素的产量提高了近45%。

（7）中心组合设计　中心组合设计由Box和Wilson提出，是响应曲面中最常用的二阶设计，它由三部分组成：立方体点、中心点和星点。它可以被看成是五水平部分因子实验，中心组合设计的实验次数随着因子数的增加而呈指数增加。

（8）Box-Behnken设计　由Box和Behnken提出。当因素较多时，作为三水平部分因子设计的Box-Behnken设计是相对于中心组合设计的较优选择。和中心组合设计一样，Box-Behnken设计也是二水平因子设计产生的。

2.最优化how（event）"class="t_tag">技术（实验统计）

目前，对培养基优化实验进行数学统计的方法很多，下面介绍几种目前应用较多的优化方法。

（1）响应曲面分析法　Box和Wilson提出了利用因子设计来优化微生物产物生产过程的全面方法，Box-Wilson方法即现在的响应曲面法（response surface methodolog，RSM）。RSM是一种有效的统计技术，它是利用实验数据，通过建立数学模型来解决受多种因素影响的最优组合问题。通过对RSM的研究表明，研究工作者和产品生产者可以在更广泛的范围内考虑因素的组合，以及对响应值的预测，都比一次次的单因素分析方法更有效。现在利用SAS软件可以很轻松地进行响应面分析。

（2）改进单纯形优化法　单纯形优化法是近年来应用较多的一种多因素优化方法。它是一种动态调优的方法，不受因素数的限制。由于单纯形优化法必须要先确定考察的因素，而且要等一个配方实验完后才能根据计算的结果进行下一次实验，因此主要适用于实验周期较短的细菌或重组工程发酵培养基的优化，以及不能大量实施的发酵罐培养条件的优化。

（3）遗传算法　该法是一种基于自然群体遗传演化机制的高效探索算法，它是美国学者Holland于1975年首先提出来的。它摒弃了传统的搜索方式，模拟自然界生物进化过程，采用人工进化的方式对目标空间进行随机化搜索。它将问题域中的可能解看作是群体的一个个体或染色体，并将每一个体编码成符号串形式，模拟达尔文的遗传选择和自然淘汰的生物进化过程，对群体反复进行基于遗传学的操作（遗传、交叉和变异），根据预定的目标适应度函数对每个个体进行评价，依据适者生存，优胜劣汰的进化规则，不断得到更优的群体，同时以全局并行搜索方式来搜索优化群体中的最优个体，求得满足要求的最优解。

掌握发酵培养基的配制原则，熟悉用正交试验优化发酵培养基的方法。

发酵条件对产物的形成有着非常重要的影响，其中培养基pH、培养温度和通气状况是最主要的发酵条件。培养基pH一般指灭菌前的pH，可用酸碱溶液调节控制，因发酵过程中pH会不断改变，所以最好用缓冲溶液来调节；通气状况可用培养基装量和摇床转速来衡量，封口纱布的厚度也会影响氧气的传递，一般以6～8层为好。

发酵培养基是指大生产时所用的培养基，一般碳源含量较高。工业发酵培养基与菌种筛选时所用培养基不同，以经济节约为主，一般选用廉价的农副产品为原料。由于天然原料的组分复杂，不同批次的原料成分各不相同，因此发酵前必须进行培养基的优化实验。

本实验将对菌株的培养基配方进行优化。

1.菌种

实验二筛选得到的淀粉酶生产菌。

2.器材

摇床，高压灭菌锅；三角瓶，烧杯，移液管，试管。

1.培养基制备

以黄豆粉、玉米粉、可溶性淀粉、酵母膏作为培养基的主要影响因素，每一因素设定3个水平，按表1-5配制培养基，另加入Na2HPO4 0.8%，（NH4）2SO4 0.4%，NH4Cl 0.15%，分装于250mL三角瓶，每瓶50mL，6层纱布封口，灭菌。取5mL蒸馏水加入试管中，灭菌。

2.接种

挑取斜面菌苔5环接入5mL无菌水中，摇匀后用无菌移液管吸取0.5mL菌悬液，接到每一组培养基中。30℃，150r/min摇床培养36h左右。

3.结果测定

参照实验四方法测定菌株在各培养基中培养的淀粉酶活力。

表1-5　发酵培养基优化正交试验表　　

将酶活力测定结果填入表1-5，通过正交分析，确定四个因素对酶活力影响的主次顺序，并确定最适培养基配方。

1.正交试验原理。

2.进行直观分析得出最佳条件

3.进行方差分析得出最佳条件。