实验四　淀粉酶酶活测定

掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法。

淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一类酶，包括α-淀粉酶、淀粉1，4-麦芽糖苷酶（β-淀粉酶）、淀粉1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1，6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）。α-淀粉酶可以从淀粉分子内部切断淀粉的α-1，4-糖苷键，形成麦芽糖、含6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，使淀粉的黏度下降，因此又称为液化型淀粉酶。

淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可以用分光光度计测定。随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。

1.粗酶液

实验二保存的菌种进行摇瓶发酵，发酵液离心后可作为粗酶液。

2.试剂

碘原液：称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500mL，贮于棕色瓶中。

比色用稀释碘液：取碘原液2mL，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500mL，贮于棕色瓶中。

2%可溶性淀粉：称取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g，用少量蒸馏水混合调匀，徐徐倾入煮沸的蒸馏水中，边加边搅拌，煮沸2min后冷却，加水定容至100mL。需当天配制。

pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）4.523g、柠檬酸0.807g，用水溶解并定容至100mL。

0.5mol/L 乙酸溶液。

3.器材

离心机，分光光度计，恒温水浴锅，试管架，秒表，试管，移液管，烧杯，离心管。

1.标准曲线的绘制（表1-1）

表1-1　标准曲线的制作　　

将可溶性淀粉稀释成0.2%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的稀释液。

吸取淀粉稀释液2mL加至试管中，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1mL，40℃水浴保温15min。

加蒸馏水1mL，40℃水浴中保温30min后，加入0.5mol/L乙酸10mL。

吸取反应液1mL，加入稀碘液10mL，混匀，在660nm下测吸光值A。

以淀粉浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，作标准曲线。

2.酶液的制备

将发酵液离心（5000r/min，10min），取上清液作为粗酶液，以pH6.0缓冲液稀释至适当浓度，作为待测酶液。

3.淀粉酶活力测定

按下列程序操作：

试管A（空白）　　　　　　试管B（酶试样，需做三个平行试样）

↓ 　　　　　　　　　　　　↓

加2%淀粉稀释液2.00mL　　加2%淀粉稀释液2.00mL

↓　　　　　　　　　　　　 ↓

加缓冲液1.00mL（摇匀）　 加缓冲液1.00mL（摇匀）

↓（40±0.2）℃，5min 　　　↓（40±0.2）℃，5min

加蒸馏水1.00mL（摇匀） 　加粗酶液1.00mL（摇匀）

↓（40±0.2）℃，30min　　　 ↓（40±0.2）℃，30min

加乙酸10.00mL 　　　　　加乙酸10.00mL

↓混匀 　　　　　　　　　　↓混匀

取反应液1.00mL 　　　　　取反应液1.00mL

↓ 　　　　　　　　　　　　↓

加稀碘液10.00mL 　　　　加稀碘液10.00mL

↓混匀 　　　　　　　　　　↓混匀

测定A660 　　　　　　　　测定A660

1.淀粉一定要用少量冷水调匀，再倒入热水中溶解，若直接加到热水中，会溶解不均匀，甚至结块。淀粉液应当天配制，配好的淀粉液应是透明澄清的，不能有颗粒状物质存在。

2.酶液应该进行适当稀释。

1.绘制标准曲线。

2.记录各样品的A660，并计算其酶活力。

酶活力单位的定义：1mL酶液在40℃、pH6.0的条件下，每小时分解的淀粉的质量（mg）。单位表示为U/mL。

1.测定酶活力时，在具体操作上应注意哪些问题？

2.为什么测定酶活力的试剂要在40℃水浴锅中预热？