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第二章 幽门螺杆菌发现历史中的Kasai、Kobayashi和科赫法则
（Yoshihiro Fukuda，Tadashi Shimoyama，Takashi Shimoyama and Barry J. Marshall）
一、引言
幽门螺杆菌是一种有鞭毛的革兰氏阴性杆菌，因为其独特的螺旋形状而得名。自发现以来，有越来越多的证据表明幽门螺杆菌与多种胃十二指肠疾病相关。目前，幽门螺杆菌感染与慢性活动性胃炎和消化性溃疡的直接关系已经阐明，同时也是胃癌的重要危险因素。虽然幽门螺杆菌直到1982年才被首次成功分离和培养，然而其发现历史可以追溯到19世纪晚期，本章将介绍日本学者在幽门螺杆菌发现历史上所作的贡献。
二、幽门螺杆菌发现故事的序幕
幽门螺杆菌感染是导致胃炎并进而发展为消化性溃疡的病因，然而在幽门螺杆菌被发现之前，胃炎的发病原因是不清楚的，所以也只能对症治疗。对幽门螺杆菌感染导致胃炎的认识，引发了胃十二指肠疾病治疗策略的巨大变革。幽门螺杆菌根除治疗在全球范围内的普及也使消化性溃疡患者的数量显著下降。此外，胃癌的发病率也在下降，胃癌在21世纪也将变成一种少见病。
幽门螺杆菌的发现与200年前接种牛痘预防天花的发现一样，具有划时代的意义。当时，天花在整个欧洲肆虐，导致大量感染者发生肢体畸形甚至死亡。虽然当时的很多医生和研究者都知道患过牛痘的患者不会染上天花，但只有一位医生意识到接种牛痘（有意或者无意）可以预防天花。这位来自英国的Edward Jenner医生向他的老师John Hunter请教了在人群中开展接种牛痘（疫苗）试验的想法。John Hunter鼓励他说：“不要只是设想，要有耐心的、准确无误的去尝试。为什么只是设想，而不去做实验呢？”于是，Edward Jenner为部分农夫接种了牛痘疫苗，接种后，没有一个人患天花。通过仔细观察牛痘患者和天花患者，Edward Jenner证明了接种牛痘能够预防天花的假设并撰文发表（图2-1）。然而，当时公众和政府部门并不相信Edward Jenner的发现，所以各大报纸也广泛刊登“接种牛痘后会变牛”的卡通图画（图2-2）。但是，Napoleon Bonaparte相信并鼓励使用牛痘疫苗预防天花。最终，在使用牛痘预防天花200年后的1977年，世界卫生组织宣布天花在地球上消灭。从那一年起，天花也不再从世界上吞噬珍贵的生命。
图2-1 Edward Jenner牛痘接种预防天花文章的封面
图2-2 “接种牛痘后会变牛”的卡通图画（获得“The Welcome Trust”的许可）
正如Edward Jenner接种牛痘预防天花的设想在开始时不被接受一样，美国胃肠病学的权威Palmer在1954年驳斥了消化性溃疡是由胃黏膜上细菌所引起的设想 ［1］（尽管在此前50年就有关于胃黏膜有细菌黏附的一致性发现）（表2-1）。Palmer的言论使得胃肠病细菌学的发展如冰封一样，停止了发展。
表2-1 幽门螺杆菌的发现历史
直到大约30年以后，澳大利亚的Robin Warren才又开始验证Palmer的观点到底是对还是错。Barry Marshall当时还是一名住院医生，他相信Warren关于胃黏膜有细菌存在的观点，并和Warren一起于1982年成功地分离并培养出了幽门螺杆菌。而在此之前，从胃黏膜组织分离培养细菌是不可想象的。尽管Marshall后来通过喝下幽门螺杆菌液证明了该细菌与胃炎的因果关系，但是如Edward Jenner一样，Marshall和Warren在《柳叶刀》（ The Lancet）上发表的幽门螺杆菌论文也被认为是异常的，没能得到医学界权威的认可。
幽门螺杆菌发现的故事可以通过以下5条共同的线索串接起来：（i）胃炎、消化性溃疡是由幽门螺杆菌感染引起的假设得到证实（推翻了以往医学界对胃炎和消化性溃疡病因的认识）；（ii）医学界权威不接受这一证实；（iii）幽门螺杆菌研究者亲自对胃炎、消化性溃疡患者实施新的治疗方案；（iv）幽门螺杆菌的发现对人类健康所作出的巨大贡献；（v）幽门螺杆菌的成功发现逐渐获得认可。在Warren和Marshall之前，很多的研究者报道了螺杆菌的发现（其中一些研究者也是本书部分章节的作者），在这里我也很高兴能够重温这些研究者发现幽门螺杆菌的故事。
三、幽门螺杆菌的早期发现
在19世纪后半期，德国细菌学家Robert Koch提出了著名的科赫法则，该法则可以用来科学地验证某种疾病与特定细菌的关系。对早期胃部细菌学家而言，利用科赫法则来验证外来细菌对胃部疾病的致病作用显得尤为重要。1881年，德国的病理学家Klebs在胃腺体腔内发现了杆状细菌，以及相应胃黏膜的炎性细胞浸润（表2-1） ［2］。意大利病理学家Bizzozero在6条狗的胃组织学检查中也发现了螺杆菌的存在。Bizzozero在1893年报道了螺杆菌存在于狗胃的幽门和胃底部，而且螺杆菌的分布从胃腺体的基底部直到上皮细胞表面 ［3］。另外，继Krienitz在1906年报道了胃癌患者胃里发现的螺杆菌之后，20世纪早期的许多研究者也纷纷报道了人体胃部螺杆菌的存在 ［4］。Luger的研究结果表明胃液内存在螺杆菌 ［5］，而且他也发现同胃癌患者相比，健康人群中胃液内的螺杆菌非常少见 ［6］。通过对胃尸检标本的分析，Doenges在43%的标本中发现了螺杆菌的存在，同时他也指出人体胃内螺杆菌的检测阳性率要比猴子低 ［7］。需要指出的是，Doenges只是在胃和肠黏膜上发现了螺杆菌。Freedberg和Barron通过银染法观察手术切除的胃组织标本发现：溃疡标本的螺杆菌阳性率为63%，而非溃疡标本中的螺杆菌阳性率仅为14% ［8］。然而，遗憾的是这些研究者们没能利用科赫法则来验证螺杆菌与胃部疾病之间的关系。
1954年，Palmer利用真空吸引管技术获得了1140例胃黏膜组织标本，以验证人体胃部螺杆菌的存在 ［1］。然而，Palmer在H&E染色胃组织标本中并未发现螺杆菌的存在，从而他得出了细菌不能在人体胃部生长的结论，而且指出以往论文报道胃部螺杆菌的存在是由于标本污染的结果。这些污染菌主要来自尸检后口腔里的污染菌，或者溃疡腐烂后滋生的细菌。Palmer也指出，口腔里的细菌成为胃液里面的过路菌是常见的。Palmer的这份研究报告也促成了后来“人体胃部无细菌生长”医学教条的产生。因此，在之后整整20年，极少有研究关注胃部细菌的存在。
四、幽门螺杆菌的发现
自胃纤维内镜的使用获得巨大发展之后，关于人体胃部细菌的报道才又开始出现。1975年，Steer利用电子显微镜研究中性粒细胞和淋巴细胞通过胃黏膜的迁移，发现胃黏膜上皮细胞有细菌的黏附，提示胃黏膜细菌定植与细胞的迁移有密切的关系 ［9］。Steer也利用电镜拍摄下了胃部细菌的照片，该细菌形状与我们现在所知的幽门螺杆菌一致。另外，Steer也比较了正常胃组织和47例胃溃疡组织黏膜上皮之间的差异，指出胃部细菌和溃疡是同时发生的 ［10］。然而遗憾的是，Steer和同事当时把幽门螺杆菌（微需氧）误认为是他们能培养的铜绿假单胞菌。1979年，Fung等人使用电镜扫描研究了29例患者的胃黏膜活检组织标本，在慢性胃炎患者的胃小凹微绒毛表面发现了很多的细菌 ［11］。
自1979年开始，西澳大利亚州皇家珀斯医院的病理学家Robin Warren通过对胃镜活检组织标本进行传统染色，发现了胃黏膜的螺旋状细菌。Robin Warren与年轻的胃肠科医生Barry Marshall一起，通过Warthin-Starry银染法清晰地观察到了胃黏膜活检组织中的幽门螺杆菌，其感染与慢性活动性胃炎（中性粒细胞浸润）的关系密切 ［12］。在首次大的连续性临床研究中，Warren和Marshall发现，几乎所有慢性活动性胃炎、十二指肠溃疡或胃溃疡患者的胃黏膜组织中都有细菌的存在。他们因此提出，胃部新发现的细菌可能是上述胃十二指肠疾病的病因 ［13］。Warren和Marshall的研究也因此验证了科赫法则第一条：“在每一病例中都发现相同的微生物，但该微生物不存在于健康者体内”。
科赫法则第二条：“要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中纯化培养出来”。Marshall是分离纯化培养出幽门螺杆菌的第一人，他与Goodwin实验室的微生物学家J. Perman合作，利用弯曲杆菌的培养技术成功地培养出了幽门螺杆菌 ［14］。在经过34次培养失败后，幽门螺杆菌最终在1982年的复活节期间被成功分离培养出来。幽门螺杆菌为有鞭毛、微需氧的革兰氏阴性细菌，看起来像是弯曲杆菌的一种新类。所以，幽门螺杆菌最初被称作幽门弯曲菌（ C. pyloridis） ［15］，但后来根据国际细菌命名准则（以拉丁文命名）， C. pyloridis又改名为 C. pylori ［16］。
五、科赫法则第三条和第四条
虽然验证了科赫法则第一条和第二条，但还有第三条和第四条需要验证。科赫法则第三条：“用分离纯化培养出来的微生物再接种到易感宿主后，必然引起同样的疾病发生”。科赫法则第四条：“从试验发病的寄主中能再度分离出这种微生物来”。后来的多个人体和猴子试验验证了关于幽门螺杆菌的科赫法则第三和第四条。
在成功分离培养出幽门螺杆菌之后，Marshall亲自喝下了幽门螺杆菌液（在喝菌液之前，他的胃黏膜组织学检查正常），之后他出现了大约持续两周的急性胃炎（轻度） ［16］。在喝下菌液的第10天，Marshall的胃黏膜组织学检查显示为胃炎。除了Marshall之外，Morris和Nicholson也亲自喝下了幽门螺杆菌液 ［17］。Morris在喝下菌液之前的胃黏膜组织学检查也是正常的，然而在喝下菌液的第3天，Morris出现了中重度的上腹部疼痛。在第11天，幽门螺杆菌成功从Morris的胃窦和胃体活检组织中分离培养出来，而且组织学检查证实Morris患上了胃炎。然而不幸的是，Morris在此后尽管服用了28天的多西环素也没能治愈胃炎，他胃部的幽门螺杆菌感染也持续存在。直到3年以后，Morris通过水杨酸铋三联疗法才根除了他胃内的幽门螺杆菌（细菌培养阴性，但是组织学检查还是有观察到慢性胃炎的微小残留灶）。这些实验的最终结果提示幽门螺杆菌可能引起急性上消化道疾病（组织学胃炎相关）。
幽门螺杆菌的长期感染动物模型是在猴子上建立的。这对幽门螺杆菌的长期感染引起慢性活动性胃炎的研究非常重要。日本学者Fukuda和同事将从人体胃部分离出来的幽门螺杆菌接种到恒河猴胃内，通过内镜观察了幽门螺杆菌的长期感染对胃黏膜的影响 ［18］。他们的实验显示，幽门螺杆菌可以在恒河猴胃部定植，并引起急性和慢性活动性的组织学胃炎。Fukuda和同事也发现，幽门螺杆菌接种到日本猕猴胃内后可以引起胃炎 ［19］，随访3年后发现幽门螺杆菌感染可以导致胃黏膜腺体的萎缩 ［20］。
虽然目前的很多研究已经验证了关于幽门螺杆菌感染的科赫法则，但是其实早在1919年，日本学者就证实了幽门螺杆菌的致病性，只是鲜有人知道而已。日本微生物学家Kasai和Kobayashi（图2-3，图2-4）从猫胃中分离培养螺杆菌，然后再接种到兔子胃内，导致了兔子胃黏膜的出血性损伤和溃疡 ［21］。根据组织学检查，兔子胃黏膜的损伤与感染的螺杆菌有关，而且在根除螺杆菌后可改善胃黏膜组织学。因此，早在幽门螺杆菌正式发现之前的60年，Kasai和Kobayashi的研究结果就已经验证了胃部螺杆菌感染的科赫法则。
图2-3 日本微生物学家Kasai医生
图2-4 日本微生物学家Kobayashi医生
六、幽门螺杆菌发现故事的结语
虽然Marshall和Warren发现了幽门螺杆菌，也强调了其感染与胃炎和消化系统溃疡的相关性，但是该发现在经过了漫长的时间后，才最终被胃肠病医生所接受。Francis Bacon在他的《新工具》一书中写道：“人们拒绝接受那些不在他们理解范围之内的事实”。许多的医学权威不相信一个小小的细菌可以导致胃炎、消化性溃疡、淋巴瘤和胃癌。Francis Bacon也说过，科学家需要仔细观察，而且只能报道事实。
1989年，“幽门弯曲菌”（ Campylobacter pylori）被认为并不真正属于弯曲菌属，而被正式更名为幽门螺杆菌（ Helicobacter pylori） ［22］。螺杆菌发现历史上一个有趣的现象是：幽门螺杆菌的研究始于太平洋国家，这是因为：①是日本学者首先发现了螺杆菌的致病性；②是澳大利亚的科学家拒绝相信Palmer的胃部无细菌理论，而选择相信人体胃部有细菌的存在。
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