循环肿瘤DNA在早期肺癌管理中的作用
1 文章背景
肺癌是全球癌症相关死亡的首要病因，仅在美国境内，2017年就有约155 870例患者死于肺癌，而其中80%死于非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。研究表明，ⅠA期非小细胞肺癌患者的5年生存率高达70%～80%［1］，而ⅢA期患者的生存率仅为24%。由此可见，对肺癌患者最重要的是尽早诊断并治疗。目前的肺癌筛查策略是对高危人群行低剂量计算机断层扫描（low-dose computed tomography，LDCT），但以此方法对局限期肺癌患者的诊断率不到40%［2］。因此，开发其他检测方法以便早期阶段识别肺癌患者已经非常迫切，这也是目前肺癌领域的研究热点之一。
循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是一种从肿瘤细胞释放入血的细胞外DNA（cell-free DNA，cfDNA），这些DNA片段含有原发肿瘤组织的完整基因组。因此，ctDNA在理论上是肿瘤组织DNA的可靠替代物。许多研究表明使用ctDNA进行癌症的诊断、肿瘤负荷监测、治疗效果监测和耐药机制检测是可行的。然而，大部分研究都集中在晚期肺癌，只有少数研究是关注ctDNA在早期NSCLC中的检测和应用的。在这篇综述中，我们总结了迄今为止的相关文献，并介绍了当前主流的检测平台，着重阐述了早期NSCLC的ctDNA特点，并展望了ctDNA在早期NSCLC中的临床应用。
循环肿瘤DNA由大约160～180bp的双链DNA的短片段组成［3］。它可能是由肿瘤细胞在坏死、凋亡或经由外泌体［4］释放的，因此，ctDNA包含有原发肿瘤的全部遗传信息，其与肿瘤DNA具有一致特异性序列［5］。数项观察性研究发现，血液中游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）的半衰期在16分钟至2.5小时之间，使得ctDNA分析能够“实时”地反映肿瘤负荷［6-8］。另有研究表明ctDNA可能通过核酸酶作用从循环中清除［7］并由肾脏排泄，而肝脏和脾脏的摄取和降解也发挥了一定作用［9］。血流中cfDNA的量约为1.0～10ng/ml［3］，而作为cfDNA中的子集，ctDNA仅占全部的0.1%～1%，因此在疾病早期阶段ctDNA含量很少。ctDNA这种片段化和微量化的特征使得其难以被量化分析。
1989年，Stroun等首先报道了癌症患者血浆中ctDNA的出现，1999年Vogelstein和Kinzler等利用数字PCR平台准确鉴定并测序出ctDNA中的突变片段［10，11］。在过去的十年里，早期癌症中ctDNA的定量分析研究有所增加。人们已经开发出具有高精度和高灵敏度的检测平台来克服以上所提到的限制，使ctDNA逐渐成为肿瘤DNA的替代物。
2 ctDNA检测方法
传统的检测方法如桑格测序法（sanger sequencing），其检测的敏感性较低并且更适合测序较长的DNA片段，并不适用于ctDNA的分析［12］。现在已经出现了很多基于聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）和二代测序（Next-Generation Sequencing，NGS）的高精度和高灵敏度的测序平台（表1）。基于PCR平台的检测方法包括：实时PCR（realtime PCR，rtPCR）、液滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）、ARMS（Amplification Refractory Mutation System） 和BEAMing（Beads-Emulsion-Amplification-and-Magnetics）。这些方法拥有高敏感性和高特异性以及高性价比，但只能检测有限的已知突变，且很难检测到拷贝数变化和融合突变［13］。其中具有代表性的检测试剂盒包括凯杰公司的Qiagen TheraScreen和罗氏的Cobas EGFR突变检测工具，它们已经获得了欧盟、美国和日本的体外诊断产品（in vitro diagnostic products，IVD）的批准。Qiagen TheraScreen EGFR RGQ血浆PCR工具（Qiagen，Hilden，德国）是一款基于ARMS-PCR技术的产品，可用于检测EGFR基因的29个突变位点，并可作为辅助诊断性血液检测用于NSCLC的治疗［14］。Cobas EGFR突变检测工具v2（Roche，Basel，瑞士）可以检测EGFR基因上的42个突变位点，并且不仅可以辅助NSCLC患者筛选可行的EGFR-TKI治疗靶点，还可以作为辅助诊断工具确定NSCLC患者是否有T790M突变（最常见的EGFR-TKI耐药机制［15］）。
基于NGS平台的方法包括通过深度测序进行个性化分析（Cancer Personalized Profiling by Deep Sequencing，CAPP-Seq），标记-扩增子深度测序（Tagged-Amplicon Deep Sequencing，TAMSeq）和离子转染测序（Ion Torrent sequencing）。这些方法无需预先了解改变的DNA序列并可以检测出拷贝数改变和融合突变，但它们都需要更长的检测周期和专业的生物信息学知识［5，6］。
在早期肺癌中，血液中ctDNA含量较少。对于微量级别的ctDNA，采用基于NGS的方法进行检测具有更好的灵敏度。NGS也称为高通量测序，涉及大量平行或深度测序，这一技术同时测序数百万个DNA片段，然后通过生物信息学技术进行重组。NGS技术不需要事先知道突变的DNA序列，就能捕获更广泛的突变，包括置换、插入和缺失［16］。精心设计的有目标的测序板可以达到万分之一以上的灵敏度［17］。如今已有几项研究显示使用NGS检测早期肺癌ctDNA是可行的。郭等和陈等的研究都显示出相当高的敏感性，分别为75.0%和78.3%［18，19］，但赵等的准确度却低至10%［20］。如表2所示，不同研究的准确度不一致，一方面是由于检测方法的不同，另一方面也可能是由于血样采集和ctDNA提取流程不一致的结果。因此，除了采用更精确的检测方法之外，还需要对样品采集、血样处理、ctDNA提取形成通用的、广泛认可的、一致的标准化工作流程。
血浆是用于ctDNA分析的首选样本类型［21］。相较于血浆，血清中cfDNA的总量比血浆中高2至24倍，其主要是由于凝血过程中免疫细胞裂解释放出大量DNA［22］。因此，使用血浆样本可以产生较低的背景干扰（野生型DNA）并获得质量更高的ctDNA。
3 ctDNA的临床应用
利用现有的技术，将ctDNA整合到肺癌管理正逐步成为现实，ctDNA与肿瘤DNA的高度一致性使得ctDNA拥有巨大的应用前景。Jing等针对EGFR阳性的NSCLC患者，共筛选出22对新鲜冷冻组织标本及相对应的血清样本，通过对比两样本的基因突变情况，显示出二者具有91.67%的一致性［26］。Guo等从41例NSCLC患者中收集的样本也显示了78.1%的一致性［18］。ctDNA分析可用于早期诊断，疗效评估及负荷监测等诸多方面。
3.1 早期诊断
大多数肺癌发现时已处于晚期，预后很差。早期诊断肺癌并早期干预，可以获得更好的预后。目前的肺癌筛查策略是在高危人群中进行低剂量CT检查。这种筛查策略被广泛使用，但由于其不稳定的预测价值而收效甚微［30，31］。此外，常规成像可使患者接触辐射。在临床实践中，包括CEA、CA19-9、CA125和神经元特异性烯醇化酶在内的肿瘤生物标志物通常用于补充对肺癌患者的诊断或监测。然而，这种传统方法因其灵敏度和特异性低而受到质疑。因此，使用ctDNA进行肺癌早期诊断已经成为了一个研究热点。一些研究已经证明了这种潜力。陈克终等比较了ctDNA和传统肿瘤标志物的预测值，研究纳入了76例肺癌患者，其中38例为Ⅰ期，这些患者在手术前留取用于ctDNA和肿瘤生物标志物检测的血浆［32］。他们发现ctDNA检测阳性能发现更多癌症患者（63.2%），高于血清肿瘤生物标志物（49.3%）。另有41例经CT检查发现孤立性肺结节（solitary pulmonary nodules，SPN）的患者中，良性病变的患者ctDNA检测均为阴性，表明通过ctDNA检测预测SPN恶性程度有极高的特异性。郭楠楠等进行了另一项研究，分析了41例患者（包括23例Ⅰ期患者）手术前血中ctDNA和以下肿瘤生物标志物CEA、CA19-9、CA125、CK19片段、神经元特异性烯醇化酶和鳞状细胞癌抗原是否存在［18］。结果显示ctDNA检测肺癌的检出率较高，阳性预测值较高（13例CYFRA21-1阳性、NSE和CEA阳性6例、鳞癌6例、CA19-9和CA125阳性2例，相比之下，34例血浆样本中有18例为ctDNA检测阳性）。这些研究都集中在早期肺癌，其中一半以上的患者是Ⅰ期，提示ctDNA可能用于肺癌的早期诊断。
然而，在Nature上发表的另一项研究的结果却不是很理想：Swanton等选择了TRACERx（TRAcking non-small cell lung cancer evolution through therapy［Rx］）队列中的100例患者，并对早期NSCLC中的ctDNA进行了系统分析［20］，总灵敏度为48%（46/96）。他们结合病理资料研究后发现ctDNA检测可能与组织学亚型有关：97%（30/31）的肺鳞状细胞癌和71%（5/7）的其他NSCLC亚型检测ctDNA阳性，而只有19%（58/11）的肺腺癌检测ctDNA阳性。由此研究观之，单独使用ctDNA可能不足以诊断早期肺癌，结合多种标志物的方法才能给癌症患者更全面的诊断。
在肺癌领域之外，Cohen等设计了一种基于PCR的检测方法来检测胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）血浆中的KRAS突变。他们纳入了221例可切除PDAC患者和182例未知癌症患者作为对照，用KRAS基因状态和蛋白质生物标志物结合的方法进行PDAC的早期诊断，早期胰腺癌的血液检测灵敏度（64%）和特异度（99.5%）都得到了明显提高［33］。此外，最近在Science上发表的一项研究应用了一种名为Cancer-SEEK的“通用”液体活检［34］。该研究小组使用8种蛋白质和16种基因的组合，成功地鉴定了1005名患有8种不同类型非转移的、临床检测到的癌症患者中的大多数（中位敏感度为70%）。这8种癌症包括一些死亡率很高的癌症，如胰腺癌和肝癌，而这些癌症目前很难早期筛查。当他们将CancerSEEK应用于812例健康对照者时，只有7例得分为阳性，提示这一技术有>99%的高特异性。此外，该研究还加入了人工智能学习技术后，在CancerSEEK检测为阳性的626例癌症患者中，83%的患者都可以局限于两个解剖部位之内。整个测试可以以相对较低的成本进行（估计<500美元）。然而，CancerSEEK测试仍然有一些局限性，因为大多数确定的病例是Ⅱ或Ⅲ期。对于Ⅰ期癌症的真正早期诊断，还有很长的路要走。
检测ctDNA异常甲基化的表观遗传学分析可以提供关于肿瘤微环境的更多信息。Xu等比较肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）组织和正常血液白细胞，成功鉴定出了HCC特异性甲基化标志物组，并发现HCC肿瘤组织DNA与匹配的血浆ctDNA之间的甲基化谱高度相似［35］。他们使用甲基化标志物组，检测了来自1098例HCC患者和835例正常对照的cfDNA样品，取得了极高的敏感性（85.7%）和特异性（94.3%）。
在肺癌领域，仅仅增加ctDNA检测中扩增子的数量以提高早期诊断的阳性率看似已经走到了尽头，结合了不同的癌症生物标志物，如蛋白质或遗传生物标志物、micro-RNA，代谢物或甲基化的ctDNA是现今可以进一步提高诊断效率的方式。
3.2 评估治疗反应
在早期肺癌患者中，一线治疗包括手术，放疗，辅助和/或新辅助化疗或联合治疗。当前监测治疗反应的常规方法包括胸部CT和肿瘤标志物的评估，至少三个月进行一次。然而，由于根治性手术后不存在特定的病变位置，所以很难评估术后化疗和/或放疗的有效性，低敏感性常常导致不能及时采取必要的干预措施，而且这一方法还使患者经常暴露在射线中。现有研究表明，人们可以轻松获得ctDNA样本来评估治疗效果和疾病进展。郭楠楠等研究了23例Ⅰ期NSCLC患者手术前后血浆ctDNA突变频率，其中，术前平均血浆ctDNA突变频率为8.88%，术后平均频率为0.28%［18］。这一研究中，91.7%的患者的血浆ctDNA突变在手术前后都有突变频率下降，并且这种显著的下降可以在手术后两天内观察到。同样，陈克终等研究了血浆ctDNA手术前、手术中和手术后检测到的体细胞突变的突变频率，表明手术前和手术过程中获得的ctDNA样本具有相同的突变，突变频率方差较低，而手术后突变频率则锐减至平均0.28%［32］。另一项由Newman等进行研究，使用CAPP-Seq分析3例晚期非小细胞肺癌患者的血浆ctDNA，发现放疗及化疗后ctDNA浓度下降，反映出了对放疗和化疗的良好反应［36］。他们还报告了1例采用立体定向消融放射治疗的IB期NSCLC患者，该患者血浆ctDNA浓度从治疗前到治疗后显著下降。由此可见，使用ctDNA评估治疗效果似乎是可能的，即使对于早期肺癌也是如此。然而，不同的研究采用不同的ctDNA检测方法，并且没有足够的数据说明何时为获得治疗后ctDNA的最佳时间。因此，将ctDNA评估治疗效果搬到实际临床应用只能在制定标准化流程和进行大规模验证研究后才能实现［37］。
3.3 微量残留疾病的检测
有研究报道即使是早期NSCLC经过根治性切除术后，其生存率依然较差，复发率最高可达20%～40%［20］。而现有的临床病理资料又不足以准确预测患者预后，因此人们进行了许多尝试以探索可提供预后信息的生物标志物，一直以来收效甚微。现在，一些研究表明ctDNA的分析可能彻底改变微小残留疾病的检测方式。Newman等使用CAPP-Seq长期监测一例立体定向消融放射治疗后的IB期肺癌的ctDNA［36］。尽管最初的监测正电子发射断层扫描（positron emission tomography-CT，PET-CT）显示仍有残留肿块，但经过21个月的随访患者没有复发，这一结果与ctDNA检测的结果是一致的。这提示放疗后检测到的残余肿块可能是炎症。Abbosh等最近的一项研究表明，使用多重PCR联合NGS检测ctDNA作为早期NSCLC患者术后肿瘤复发的生物标志物。这一研究在TRACERx临床试验的支持下进行，患者每3个月随访一次，并在研究入选后的头两年以及此后每6个月进行一次临床评估和胸部X线片检查［20，38］。在CT临床确认之前的70天中，14个复发病例中的13个中都检测到了ctDNA。这一研究验证了长期监测ctDNA以监测早期肺癌复发的可行性。Chaudhuri等应用CAPP-Seq分析了40例接受治愈性Ⅰ～Ⅲ期肺癌治疗的患者（包括7例Ⅰ期患者）的ctDNA，发现94%可评估的复发患者的首次治疗后血样中都检测到了ctDNA［38］，长期监测显示治疗后应用ctDNA检测在72%患者中比影像学提前中位数5.2个月发现复发。可见，ctDNA已经显示出识别早期复发的潜力，但目前这一临床应用还受到成本和当前ctDNA检测平台的灵敏度的限制［39］。
3.4 临床科研的应用潜力
最近发表的一项研究数据表明TKI可作为辅助治疗的选择［40］。然而，这一研究结果的价值存在争议［41］。TKI辅助治疗的试验均未显示总生存期的获益［40，42］。未来的辅助TKI治疗试验应明确界定选定患者TKI治疗的起始时间和持续时间，以使治疗效果最大化。要实现这一目的，就需要一种评估血浆ctDNA动态变化的方法。
同样，新辅助靶向治疗试验的不同结局提示肿瘤组织基因检测的局限性［43，44］。穿刺取样得到的小块肿瘤细胞基因具有高异质性，限制了基因突变的鉴定［45］。而从血浆ctDNA获得的数据，对于指导TKI新辅助治疗的临床试验，可能更加可靠和实用。
4 结论
在最初发现ctDNA后的几十年中，我们对ctDNA的生物学性质有了更深入的了解。随着灵敏度越来越高的检测平台的发展，ctDNA已经开始在肺癌治疗中发挥更加重要的作用。由于其可重复、无创伤、易获取的特性，ctDNA已被许多研究证明具有巨大的临床应用价值，包括早期诊断、评估治疗反应、监测肿瘤负荷、鉴定耐药性和早期发现复发等等。对于早期NSCLC，几项研究已经证实以ctDNA基因代表肿瘤DNA基因的可行性，并且已经有一些研究人员开始研究其临床应用。不过在将ctDNA用于临床实践之前，人们仍然面临许多挑战。为应对这些挑战，我们提议应使用标准化的方案和广泛认可的工作流程来检测ctDNA。此外，未来的研究需要获得更多的ctDNA相关生物学信息，以作为临床应用的理论基础。另外，未来还需要开发更敏感的ctDNA检测平台，并且需要控制成本。总体看来，ctDNA的检测技术将继续蓬勃发展，并在不久将来成为肺癌精准治疗的一部分。
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