第六节 乳中的酶
在牛乳中存在超过60种不同的内源酶。内源酶主要是指自然酶类，可能存在于牛乳的不同组分中，大多数与脂肪球膜交联，其他酶则在溶液中，即分散在乳清中；但其中的一些酶（如脂蛋白脂肪酶）可与酪蛋白胶束交联。
一、牛乳中主要的酶
（一）牛乳中抗细菌酶类
1.乳过氧化物酶
未经处理的新鲜牛奶受到细菌污染会使其短时间内无法保存。冷藏可减缓细菌增长速度，但是在发展中国家的大部分地区冷链不完善，牛奶染菌变质的风险较大。乳过氧化物酶（LPO）（EC1.11.1.7）是牛乳中具有抗菌防御能力的内源酶，在牛乳中含量较高，特别是在牛初乳中含量最高。乳过氧化物酶与硫氰酸及过氧化物共同构成过氧化物酶体系，LPO催化SCN－氧化生成氧化硫氰酸根（OSCN－），OSCN－具有抗菌活性。三者同时存在的情况下，乳过氧化物酶体系被激活，发生抑菌作用。它催化反应如下：
底物HA可为：芳香胺、苯酚和维生素C等。这类酶还可用H2O2催化氧化硫氰酸根（SCN－），形成一个不能确定的成分，它们可以抑制大多数的细菌。如果细菌自身产生H2O2，则它们自身被抑制。硫氰根与饲料中的氰基葡糖苷相关，因此在牛乳中的浓度变化很大。在生奶中添加硫氰酸和H2O2，可以避免乳的腐败。通过这种方法即使在常温的贮藏条件下，牛乳也可以存放数小时。在牛乳中，乳过氧化物酶-氢过氧化物-硫氢酸盐体系（这通常发现在唾液中）被黄嘌呤氧化物酶加强。
乳过氧化物酶体系对于革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌的抗菌作用包括降低氧气摄入，减少乳酸产量，抑制微生物酶以及膜的结构损伤，从而对细菌的生长加以抑制。对于一些革兰氏阴性菌，如大肠埃希氏杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌以及志贺氏杆菌等，乳过氧化物酶可起到杀菌作用。另外乳过氧化物酶体系对于真菌、病毒同样具有抑菌和杀菌作用。适当的pH、温度、培育时间、细胞密度和存在特殊供体的条件下，上述的微生物可被抑制。目前已证明此体系通过暂缓嗜冷微生物的生长，延长了生牛乳在10℃下的保藏时间。
乳过氧化物酶相对耐热，72℃、15s巴氏杀菌后仍具有活力。研究表明，由于芽孢的热休克作用，72℃、15s的巴氏杀菌乳要比80℃、15s的巴氏杀菌乳的保藏性好。尽管乳过氧化物酶在80℃、15s时丧失活性，在72℃、15s时其活性还有70%。乳过氧化物酶的其中一个应用是添加到复原的婴儿配方中，可以抑制肠病原体阪崎肠杆菌。
由于乳房炎乳中乳过氧化物酶含量会增加，因此可将乳过氧化物酶活性作为检测乳房炎的一个指标。LPO会引起不饱和脂类的非酶氧化，但在这方面热变性的酶比天然的酶活性更高。
2.黄嘌呤氧化酶
黄嘌呤氧化酶（EC1.1.3.22）可产生过氧化氢，是一种较高活性的抗菌剂，作为一种黄嘌呤代谢的副产品，有助于提升牛奶杀菌能力，是目前研究得最多的乳中固有酶之一。它是一种非特异性的氧化还原酶，在嘌呤分解代谢中起作用，能够催化次黄嘌呤氧化成黄嘌呤，或是将黄嘌呤氧化为尿酸。并且可将硝酸盐转化为亚硝酸盐，代谢为一氧化氮。牛奶中黄嘌呤氧化酶的数量很多，仅次于过氧化物酶。另外黄嘌呤氧化酶可以催化各种氧化底物，不仅是黄嘌呤，包括O2，可作为氢的受体，这种性质可用于干酪的制造。牛乳中含有的高活性黄嘌呤氧化酶，大多数和脂肪球膜相连，因此仅具有部分活性。超氧化物歧化酶（EC1.15.1.1）催化超氧化物阴离子O－2，歧化为过氧化氢和三个O2：
乳中这类酶是相似的，但与血液中的不同，它的生理功能是保护细胞免受氧化损害。在牛乳中，超氧化物阴离子可以由黄嘌呤氧化酶和乳过氧化物酶催化氧化产生，或被核黄素光氧化。超氧化物歧化酶可以抑制牛乳成分的氧化，这类酶可抑制脂类的自然氧化，这类氧化产生异味。在巴氏杀菌条件下该酶不会失活。
巯基氧化酶催化巯基氧化为二硫化物，以O2作为受体：
无论作用物的分子大小，化合物的—SH基团都被分解，大多数酶类和脂蛋白结合。巴氏杀菌只能部分使酶失活。在巴氏杀菌乳中，由—SH引起蒸煮风味。这种酶具有重要的消除作用。
3.其他具有抗微生物活性和抗病毒功效的内源酶
溶菌酶是另外一种杀菌酶，可催化细菌细胞壁的构成成分N-乙酰胞壁酶和N-乙酰葡萄糖胺间β-1，4糖苷键的水解反应，直到引起细菌溶解。溶菌酶存在两种类型，即C型溶菌酶和G型溶菌酶，可对大部分革兰氏阳性菌和少数革兰氏阴性菌起到作用。若体细胞数增加及患有乳房炎，则溶菌酶活性增强。
（二）磷酸酯酶
1.碱性磷酸酶
牛乳中存在一些磷酸酯酶，最常见的是碱性磷酸酶（ALP）（EC3.1.3.1），可催化磷酸单酯的水解。碱性磷酸酶的重要性在于，可通过其来检测巴氏杀菌牛乳，这类酶的失活意味着所有的致病微生物（包括乳结核分歧杆菌）在加热时已被杀死，同时大多数但并非全部的乳酸菌及革兰氏阴性菌也被破坏。这类酶多存在于脂肪球膜中，因而当此检验应用于脱脂乳时敏感性较差。另外值得注意的一点是大多数磷酸酶的最适pH值和温度接近生理水平值，但碱性磷酸酶和蛋白磷酸酶比较特殊，它们的最适pH值分别为9.8和4.0～5.5。碱性磷酸酯酶的活性可以用于区分生奶和巴氏消毒乳，因为它的热稳定性和牛乳的巴氏消毒的最低条件接近。
牛的个体和季节变化会导致牛乳中碱性磷酸酶的含量有差异。初乳中ALP含量较高，分娩后1～2周内降到最低，随后含量稳定。ALP是一种含唾液酸的糖蛋白，其活性可以用作巴氏杀菌程度指标。ALP灭活比结核分歧杆菌需要稍高的温度和时间，而结核分歧杆菌是巴氏杀菌乳中对热抵抗力最强的病原菌。ALP灭活在法规限制内的乳和乳制品都可以认为是充分巴氏杀菌的，可以安全使用。虽然ALP通常被广泛用作高温短时巴氏杀菌乳灭菌的一个指标，但它可能不是最合适的，主要原因由于：①在某种条件ALP的再激活使得ALP的测试复杂化；②在低巴氏杀菌条件下（70℃、16s）酶可能完全失活；③乳中最初活性和巴氏杀菌强度（PE）之间的线性关系不如PE和乳过氧化物酶或γ-谷氨酰基转肽酶之间明显。据报道，碱性磷酸酯酶在高度浓缩时（比如超滤牛乳）更容易失活。
2.酸性磷酸酶
牛乳中也含有酸性磷酸酯酶（ACP）（E C 3.1.3.2），它存在于乳清中，具有相当的耐热性，其活性比碱性磷酸酶低很多。研究表明健康牛乳中只含有一种ACP，而乳房炎乳中含有另两种ACP。乳房炎乳的ACP活性要比正常的牛乳高4～10倍。
酸性磷酸酶对热很稳定，完全失活需要在88℃加热30min。在LTLT杀菌中ACP活性会有10%～20%的损失，而在正常的HTST杀菌过程中其活性不受影响。在100℃，pH6.7下加热牛乳5s，ACP活性不会受到影响。在100℃、加热20s，90%的活性损失。瓶内灭菌或UHT处理能使ACP活性完全丧失。ACP与ALP相比具有较高的热稳定性，并且适应更低的pH。ACP对酪蛋白的脱磷酸作用会降低乳制品的热稳定性。
（三）脂肪酶和酯酶
牛乳中存在一些脂肪酶，可以水解脂肪。牛乳中最主要的分解脂肪酶是脂蛋白脂肪酶（EC3.1.1.34），它从甘油三酯和甘油二酯释放脂肪酸，且仅在油水界面有活性。脂蛋白脂肪酶主要以和酪蛋白胶束交联的形式存在。当牛奶脂肪球膜完整时，脂蛋白脂肪酶不会与底物接触，特别是甘油三酯；但是当脂肪球膜被损坏或者有特定的血清脂蛋白存在时，甘油三酯容易被脂解，使得游离脂肪酸浓度提高。另外，一些牛奶样品会进行自发的脂肪分解，可能是由于活化物质（例如载脂蛋白）和抑制剂（例如蛋白质和肽）的失衡。巴氏杀菌会减少牛奶中脂蛋白脂肪酶的活力，但是完全灭活则需要更多热处理（Deeth，2006）。
脂肪酶的活性强烈地受其他产物抑制，如长链脂肪酸。它的存在可能会阻止乳的快速酸败，其活性受焦磷酸盐、氯化钠（1mol/L）、精蛋白硫酸盐及多聚阴离子抑制。脂肪酶不稳定，紫外线、热、酸和氧化剂都能使之失活。因此，在热处理乳和乳pH值下降时，脂肪酶不稳定。
在最适条件下（pH9.2、37℃），牛乳中的脂肪酶能产生2μmol/min的游离脂肪酸。该值理论上10s就足以引起酸败；由于低的存储温度（约5℃）、乳的pH（6.7）、完整的脂肪球膜及内源抑制物的存在，实际上脂肪酶水解释放脂肪酸的情况不会发生。脂解会增加短链脂肪酸、挥发性脂肪酸的含量，它们会产生酸败。脂解产生酸苦的、不干净的、肥皂味和辛辣的气味，使市售乳及乳制品不能被消费者接受。脂肪酶对由鲜乳做的干酪的脂解显著，对由巴氏杀菌乳制成的干酪影响较小，因为经过巴氏杀菌后脂肪酶的活性剩下不到10%。
（四）蛋白酶
1.体细胞蛋白酶
牛奶中含有的体细胞种类多样且其数量可变。几种蛋白水解酶及其活性与牛奶中的体细胞有关。体细胞蛋白酶的释放可能来自分泌作用或损伤的细胞。但这些酶是来自于体细胞的最终决定性证据还没有被证实。其存在和活性与体细胞数量相关。急性乳腺炎会导致牛奶中存在大量的体细胞，其酶谱与慢性乳腺炎中的酶谱有所不同；慢性乳腺炎使得牛奶中的大部分细胞是巨噬细胞。
在牛奶中存在的所谓的体细胞蛋白酶，首先被提及的应该是溶酶体天冬氨酸蛋白酶组织蛋白酶D。天冬氨酸蛋白酶在牛奶中存在的主要活性来自促组织蛋白酶D（procathepsin D），而非成熟的组织蛋白酶D（Larsen et al.，1993）。在酸性pH3.5～5.0范围内，促组织蛋白酶D可自动激活为具有蛋白水解活性的中间体形式，成为伪组织蛋白酶D。由于很多奶酪的pH值在5.0左右，因此组织蛋白酶D和伪组织蛋白酶D可以将酪蛋白降解成为一定的片段，类似凝乳酶，甚至于向牛奶中添加一定数量，也可将牛奶凝固。组织蛋白酶D在牛奶中比在黄油中更稳定，在72℃经历高温短时的巴氏杀菌后，组织蛋白酶D和伪组织蛋白酶D大约还存在一半的活性。牛奶中促组织蛋白酶D和组织蛋白酶D主要与乳清相关。因此其主要意义在于，其与超滤粗制凝乳酶奶酪，如超滤羊乳酪、夸克以及农家奶酪的品质有潜在的关联。在一些瑞士类型奶酪中组织蛋白酶D和伪组织蛋白酶D可能仍然具有活性。虽然添加的凝乳酶可能已经热失活，在乳清粉和其他发酵产品中可能存在相同的状况。在夸克奶酪和超滤羊乳酪中组织蛋白酶的活性已经被检测到。
半胱氨酸蛋白酶的活性在牛奶中被检测到，并且已经分离到不同类型的半胱氨酸蛋白酶。一个部分纯化的组分在72℃加热30s后仍然保留半胱氨酸蛋白酶活性，免疫印迹法显示了具有免疫反应的组织蛋白酶B的存在。其他类型的半胱氨酸蛋白酶，除了组织蛋白酶B，既与部分纯化馏分的不同特性相关，也与存在于溶酶体中的半胱氨酸蛋白酶的种类相关。牛奶中组织蛋白酶B的成熟形式与酶的最终形式的区分还要进一步验证。与组织蛋白酶D类似，组织蛋白酶B也可以水解酪蛋白，但是特异性不同。
2.肽链内切酶
在牛乳中，至少存在两种类似胰蛋白酶的肽链内切酶。其中之一是碱性牛乳蛋白酶，它和血液中的血浆酶相同（EC3.4.21.7）。牛乳中大多数的碱性蛋白酶以非活性血浆酶原形式存在，这种酶主要和酪蛋白胶束结合。它在牛乳中的活性变化范围很大，这部分是因为纤溶酶转化成纤溶酶原的比率是变化的。通常活性随着加热时间延长（如巴氏杀菌）而增加，一种解释认为是巴氏牛乳中包含一个或多个启动子催化纤溶酶原产生纤溶酶。同时牛乳的血浆酶的转化和干乳过程相关。在泌乳的后期纤溶酶和纤溶酶原的减少水平由牛生长激素决定。另外，牛乳至少包含一种物质抑制这个启动子，这种抑制剂在加热后失活。白细胞中含有启动子，含有较高的体细胞的牛乳通常可以提高乳的蛋白酶活性。
（五）纤溶酶体系
牛奶包含全部的纤溶酶体系，即纤溶酶原、尿激酶型纤溶酶原激活剂、组织性纤溶酶原激活剂、纤溶酶及纤溶酶原的抑制剂以及纤溶酶原激活剂的抑制剂。纤溶酶原是一种丝氨酸类型的蛋白水解酶的酶原，最佳pH为7.5，是牛奶中主要的蛋白水解酶成分，可水解各种乳制品中的蛋白质，影响乳制品的气味和质地。在牛奶中通过切割多肽链中赖氨酸和精氨酸的残基，纤溶酶可降解牛奶中的蛋白质。水解酪蛋白，将产生小片段。如γ-酪蛋白和朊蛋白胨（β-酪蛋白的片段）以及λ-酪蛋白（αs1-酪蛋白的片段）。纤溶酶本身相对热稳定，即使在UHT牛奶（135～140℃加热3～4s）中仍存在低活性，可能是由于残留的纤溶酶原激活剂对于纤溶酶原的激活作用。事实上，纤溶酶和纤溶酶原的抑制剂可能相对于酶本身或是激活剂而言热不稳定，但是对于巴氏杀菌处理提高了牛奶中的纤溶酶活性，并因此造成酪蛋白的水解。纤溶酶也可降解由凝乳酶产生的肽。纤溶酶/纤溶酶原系统在牛奶中已被广泛研究。生奶中纤溶酶的高活力会导致活性蛋白含量较低，从而可能也会导致较低的奶酪产量，但是纤溶酶的活性在奶酪成熟中起到积极作用，通过酪蛋白的水解，微生物蛋白酶随之产生反应，进而影响奶酪的味道和质地。鲜乳中纤溶酶原的浓度远高于纤溶酶的浓度，但是在存储过程中，由于纤溶酶原激活剂作用，纤溶酶的浓度增加。由于纤溶酶活性对产品质量及加工成本的重要性，对纤溶酶的研究主要集中于活性控制方面，通过增强或抑制影响纤溶酶活性的因素，从而实现这种控制。
二、乳中存在的其他酶
（一）乳过氧化氢酶
过氧化氢酶是氧化还原酶，是一种血红素蛋白，可以催化分解过氧化氢，也可以催化相关的过氧化物酸，如甲酸、亚硝酸、低脂肪醇及羟胺的氧化。原料乳中过氧化氢酶的活力与体细胞数呈正比。因此，过氧化氢酶活性也是诊断乳房炎的一个指标。
牛乳中的过氧化氢酶是一种低聚物，由疏水交互作用维系的亚基构成。牛乳中至少包含两种过氧化氢同工酶，这些同工酶在免疫化学性方面相似，Cu2＋、Fe2＋、Hg2＋、Sn2＋、CN－和N－3可以抑制过氧化氢酶。牛乳过氧化氢酶的最适温度为20℃，在pH8.0的缓冲溶液中加热到70℃，保持30min会失活。牛乳在77～83℃加热20s，88～90℃加热3min或91～95℃加热5min，酶活性分别损失63%、74%、84%。加热后的牛乳在冷藏期间过氧化氢酶活性会再恢复，可能是由于巴氏杀菌后幸存的微生物释放了过氧化氢酶。因此，生产25h以内的巴氏杀菌牛乳中的过氧化氢酶活性可作为微生物生长的指标。
（二）超氧化物歧化酶
超氧化物歧化酶（SOD）（EC1.15.1.1）可催化超氧阴离子O－2的歧化作用，反应如下：
H2O2可作为过氧化氢酶、过氧化物酶或其他适当还原剂的底物。SOD可在厌氧环境中保护组织不受自由基的侵害。O－2基团是黄嘌呤在高pH、高氧及低黄嘌呤浓度条件下被黄嘌呤氧化酶氧化的产物，对活体物质有潜在的威胁。
SOD存在于乳清中，牛乳中浓度为0.15～2.5mg/L，人乳中SOD活性低于牛乳，牛乳和人乳中SOD的电泳及色谱特性与红细胞提取出的SOD相同，这表明乳SOD源于血浆。但是乳中SOD的活性与泌乳期、牛的年龄或乳房炎等影响乳腺细胞膜的通透性的因素无关。
常规巴氏杀菌（72℃，15s）对乳中SOD活性没有影响，而经75℃加热20min，其活性仅剩25%。因此高SOD活性会减少乳因氧化产生的酸败昧，通过清除黄嘌呤氧化酶氧化其底物时而产生超氧离子，SOD对保持牛乳氧化稳定性起到重要作用。
（三）L-乳酸脱氢酶
乳酸盐脱氢酶（LDH）（EC1.1.1.27），也称乳酸脱氢酶，能催化乳酸盐到丙酮酸盐的可逆反应，过程如下：
由于LDH通过血液进入牛乳，在乳房炎乳或初乳中其活性要高于常乳。在初乳中LDH同工酶的浓度从LDH-5到LDH-1逐渐减少，而在泌乳期却相反。在成熟期牛乳中，LDH活性的95%都来源于LDH-1。目前已经有报道用牛乳中LDH活性来作为乳房炎的指标。尽管LDH可能在发酵过程中起作用，但其在乳品加工中的重要性还没有证实。
（四）巯基氧化酶
巯基氧化酶可催化半脱氨酸及含巯基的肽或蛋白质的氧化反应，从而在蛋白质三维结构形成的过程中发挥作用。该反应以O2分子作为电子受体，产生H2O2及相应的二硫化物。反应如下：
2RSH+O2→RSSR+H2O2
目前，在牛乳中发现的巯基氧化酶尚没有EC命名，因此经常和巯醇氧化酶（EC1.8.3.2）混淆。然而，牛乳中巯基氧化酶的分子特性和生化特性与硫醇氧化酶明显不同。哺乳动物的的巯基氧化酶与黑曲霉的也不相同。与牛乳巯基氧化酶不同的是，微生物的酶是一种可溶性黄素蛋白质，耐酸性较好，可在pH3.0以下存活。
巯基氧化酶存在于各种初乳和常乳中。牛乳中含有约10mg/L的巯基氧化酶，其中大多数结合于脱脂乳膜中。同样，95%人乳中的巯基氧化酶也存在于脱脂乳中。牛乳中的巯基氧化酶对酸很敏感；而人乳中的巯基氧化酶通过胃肠道可部分存活。市售加工牛乳中含有的巯基氧化酶活性约为原料乳的40%，这表明经过加热杀菌后巯基氧化酶仍有部分存活。由巯基氧化酶作用而产生的可能参与乳过氧化物酶体系。向UHT乳中添加纯化酶可减少蒸煮味，同时由于脂类氧化减少可增强风味的稳定性。