1.5　CRISPR-Cas系统的非基因组编辑方法

1.5.1　用CRISPR-Cas13和rCas9靶向RNA

CRISPR-Cas的最新发现之一是2类Ⅵ型的Cas13（Cas13a、Cas13b和Cas13c），在2015年由Shmakov等人报道[6]。应当注意的是，Cas13a以前被称为C2c2（Cas13b=C2c4，Cas13c=C2c7）[6,20,21]，并且一些文献交替地使用这些名称。Cas13与其他主要的CRISPR-Cas系统（例如CRISPR-Cas9）的区别在于，它靶向单链RNA（ssRNA）而不是双链DNA（dsDNA），并且倾向于非特异性切割RNA[20,21]。与大多数先前描述的系统不同，Cas13仅由一个单独的crRNA分子而非crRNA/tracrRNA复合体引导。将Cas13与Cas类型区分开的另一种机制是其双HEPN核酸酶结构域，该结构域在切割后会在靶RNA中产生平末端[20,21]。O’Connell等和Nelles等通过修饰PAM递呈寡核苷酸（PAMmers）来产生CRISPR-Cas9（CRISPR-rCas9）系统的突变体[22,23]，该突变体可以像CRISPR-Cas13系统一样靶向ssRNA。这些PAMmer将引导Cas9特异性结合靶ssRNA序列[22,23]。

1.5.2　CRISPRa/CRISPRi、表观遗传修饰和标记

Lundh等证明[24]，Cas9蛋白可以被酶促灭活（dCas9），失去其切割能力，但保留了靶向和结合特定DNA序列的能力。可以将此dCas9蛋白与激活子或阻遏子结构域结合，来系统性地激活或抑制上游基因。这是一个可逆的过程，因为基因组没有被直接编辑[24-27]。一个简单的模型，激活子或阻遏子结构域附着到dCas9复合物上，导致一个或几个上游基因的激活（进而转录）或被抑制。当使用激活域时，该系统称为CRISPRa；当使用阻遏域时，该系统称为CRISPRi[24-27]。这些技术已经发展成为有用的遗传筛选工具[28,29]。CRISPR-dCas9还有另一个用途：表观遗传修饰。通过将dCas9复合物连接到已知的表观遗传修饰因子［例如组蛋白脱甲基酶（LSD1）或人乙酰转移酶（p300）］，dCas9可以非常精准地靶向基因组。这种机制与其他CRISPR-Cas系统的区别在于，dCas9-LSD1复合物作用于染色质，而基因组仍包裹在组蛋白中。因此，这些修饰是调节遗传基因表达的有用工具。这些复合物也可用于激活或抑制转录，例如，LSD1抑制了小鼠胚胎干细胞中的多能性维持基因（例如Oct4和Tbx3）[25]。研究人员对Cas9和Cas13系统都进行了改造，使之用作遗传标记（dCas9用于DNA, dCas13用于RNA）。例如，Chen等人证明了标记有绿色荧光蛋白（EGFP）的dCas9复合物可以被gRNA引导至目标序列，然后在EGFP动态成像过程中发出荧光[30,31]。