CRISPR基因编辑技术
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2.2 基因编辑技术的历史先河:基因打靶技术

真正实现在哺乳动物中进行基因编辑,实际上是起始于20世纪70年代的基因打靶技术。基因打靶技术最典型的例子就是在小鼠中实现对特定基因的敲除[1]。早在1977年,意大利裔美国科学家Mario R. Capecchi就开始致力于开发显微注射技术,尝试将DNA通过一个非常纤细的、口径只有1μm的玻璃管注射到哺乳动物的细胞核中。另外,在20世纪80年代初期,他发现了外源DNA片段可以以同源重组的方式整合到哺乳动物细胞的基因组中。在这个时期,他开始研究如何在哺乳动物个体上实现对某个基因的特定编辑。与此同时,美国科学家Oliver Smithies也在进行着这项研究。他们要解决两个问题:一是如何在哺乳动物细胞内对靶基因进行编辑,二是如何将这个编辑好的基因转入到小鼠的生殖腺并使之传代。首先的尝试是从哺乳动物细胞开始的。1985年,Smithies团队在《自然》发表文章,成功将一段DNA序列插入到人类β球蛋白基因中[2],然而,这并没有解决传代的问题。

在1981年,英国科学家Martin J. Evans为他们提供了一个解决方案:他成功分离并培养出了小鼠胚胎干细胞(ES细胞)[3],并在1984年证实了体外培养的ES细胞可以被移植到小鼠体内,并在小鼠体内分化为生殖细胞[4]。得知这个研究成果之后,Capecchi和Smithies的研究团队就开始致力于研究如何将设计好的DNA载体(targeting vector)转入ES细胞,提高同源重组的效率,并着手制作基因编辑小鼠[5,6]。在激烈的竞争下,多个课题组在1989年报道了多系利用基因打靶技术制作的基因编辑小鼠[7-10]。而作为这个技术的开创与完善者,Mario R. Capecchi、Martin J. Evans和Oliver Smithies共同分享了2007年的诺贝尔生理学或医学奖。

基因打靶技术的流程示意图参见图2.2[11],这个过程可以大致分为两步。第一步需要在小鼠ES细胞中进行基因编辑的操作,主要是通过基因打靶载体的构建和利用电击穿孔法进行ES细胞转染,实现对ES细胞的基因打靶。第二步则是利用显微注射的方法,将筛选出的携带基因突变的ES细胞注入小鼠的胚泡(blastocyst)中。待嵌合体小鼠诞生后,通过回交测试ES细胞是否分化进入了生殖腺,最终完成基因打靶的操作。

图2.2 基因敲除小鼠的制作流程[11]

基因打靶的整个实验过程相对漫长,而且对技术的要求也比较高。通常情况下,制作一系基因敲除小鼠需要一年以上的时间,比较耗时费力。但是,基因打靶技术开拓了哺乳动物基因编辑的先河,为即将出现的多种基因编辑技术奠定了坚实的技术和理论基础。从基因打靶而得到发展的多种基础实验技术,包括干细胞分离、培养以及鉴定技术,电击穿孔转染技术以及显微注射技术,直到现在仍被广泛应用。