2.3　昙花一现：锌指核酸酶技术和类转录激活因子效应物核酸酶技术

虽然基因打靶技术成功地解决了在哺乳动物中进行基因编辑的问题，但是由于它主要依赖自然发生的DNA同源重组机制，效率极其低下。在自然条件下，外源DNA在基因组中发生同源重组的概率可能仅有数百万分之一。因此，要经过层层筛选才能得到正确的ES克隆。然而，如果DNA发生断裂，然后再利用携带同源序列的外源DNA模板进行修复的话，同源重组发生的概率就会大大提高，其效率甚至可以达到7%～10%。按这个思路考虑，如果能有一把剪刀，在想要进行编辑的地方先切上一刀，通过这种方式触发细胞自身的DNA修复机制并利用外源DNA模板进行修复，那基因编辑的效率就会提升数万倍，人们也就可以随心所欲地进行基因编辑了。那么问题来了，自然界中有没有一种可以像GPS一样精准定位并进行基因剪切的工具呢？答案是肯定的，锌指核酸酶（ZFN）技术首先解决了这个问题。

20世纪80年代初，在对RNA转录因子TFⅢA（transcription factor ⅢA）进行研究的过程中，美国华盛顿大学的Robert Roeder及其团队发现这个转录因子可以找到基因组DNA上的特定序列，也就是编码5S RNA的那一段序列，并随后鉴定出了TFⅢA的完整序列。在1985年，英国化学家Aaron Klug提出了锌指结构模型[12]。在这个模型中，TFⅢA的DNA识别模块包括30个氨基酸，而这些氨基酸则围绕在锌离子的周围，形成了一个手指样的立体结构。而这根“手指”恰好可以识别一种特定的DNA三碱基序列（图2.3）。可以想象，如果把多个锌指按顺序组合起来，理论上就可以识别并定位任意DNA序列了。虽然这个过程需要大量工作和计算机的帮助，但是锌指结构的发现，为基因编辑找到了第一个可以精准定位的“GPS”。

图2.3　锌指结构示意图

（a）DNA与多个锌指结构对应结合；（b）两个放大的锌指结构

定位的问题算是暂时解决了，但是，负责对DNA进行剪切的“剪刀”在哪里呢？最常见的“剪刀”就是限制性内切酶。众所周知，普通的限制性内切酶比较局限，只能识别特定的序列，比如EcoRⅠ，它只能识别GAATTC序列。如果想要编辑的DNA不含有这种序列，它就没有用武之地。1996年，美国约翰斯·霍普金斯大学的分子生物学家Srinivasan Chandrasegaran对一种限制性内切酶FokⅠ进行改造，使它正式应用到基因编辑领域中来。FokⅠ所识别的DNA序列是GGATGCATCC，而非常有趣的是，FokⅠ上识别DNA的部分和对DNA进行切割的部分是完全独立的。Chandrasegaran和他的同事们利用了这种特性，将锌指酶与FokⅠ的切割模块整合了起来，并将之命名为锌指核酸酶ZFN（图2.4），开启了精准基因编辑的时代[13]。

图2.4　锌指核酸酶ZFN示意图

1、2、3表示锌指蛋白，每个锌指蛋白对应3个碱基；FokⅠ则负责对DNA进行剪切的工作

ZFN使用起来非常繁琐，尤其是锌指部分，想找到合适的、对应三个碱基的锌指模块非常不易。有没有对应单个碱基的“锌指”或更简便的方法呢？科学家们并没有停止探索。在2009年，德国马丁路德哈勒-维腾贝格大学的细菌学家Ulla Bonas团队和美国爱荷华州立大学的Adam Bogdanove团队同时在《科学》杂志发表文章[14,15]，指出从黄单胞菌（Xanthomonas）中分离出来的类转录激活因子效应物（transcription activator-like effector, TALE）可以识别单个DNA碱基。TALE的中心靶向结构域由33～35个氨基酸重复序列组成。这些重复序列中仅有两个氨基酸不同，而这两个氨基酸残基，则决定了其可以识别的单核苷酸。文章发表后，引起了全世界的基因编辑科学家的关注，因为大家都看到了对ZFN进行改良的可能性，即用TALE去替代ZFN中的锌指部分，这也代表了TALEN（类转录激活因子效应物核酸酶）技术的诞生。TALEN的结构示意图见图2.5，每个TALE都对应一个DNA碱基。在2011年，多个科研团队都发表了他们开发的TALEN试剂盒，这包括Bogdanove团队、美国麻省总医院（Massachusetts General Hospital）的韩裔美籍科学家Keith Joung团队和麻省理工学院-哈佛大学博德研究所（Broad Institute）的华裔科学家张锋团队。显而易见，与ZFN相比，TALEN的优越性在于每个TALE都对应一个DNA碱基，这使基因编辑的初始设计的工作量大大简化。因此，TALEN基本上取代了ZFN。

图2.5　TALEN的结构示意图

然而，无论是ZFN，还是TALEN，都未能在基因编辑领域引起广泛的应用，原因是多方面的。首先，这两项技术都需要进行复杂的设计，其中包括大量的计算机模拟和后续的蛋白质合成。在21世纪初，这种计算机模拟还不是很普及，在很大程度上限制了人们的应用。另外，ZFN技术出现后，美国的圣加蒙（Sangamo Therapeutics）公司对ZFN技术进行了全面的收购，并对其进行专利保护，使ZFN技术成为圣加蒙公司的私有产品，其他人基本不能再对ZFN技术加以利用。虽然后来科学家们开发出了公益性的ZFN设计平台，其中代表性的为Keith Joung和同事们开发的“OPEN”平台，但是繁琐程度以及高昂的实验预算还是让许多人望而却步。最重要的是，在TALEN技术出现后的仅1年，一个崭新的、真正具有革命性意义的基因编辑技术划空而至，它就是CRISPR技术。尽管有些人不愿承认，但是CRISPR的出现，使ZFN和TALEN技术受到了冷落，并被藏到了基因编辑工具箱的角落，很少有人再去使用它们，也再没有人花精力去对其进行完善。它们就像昙花一样，在基因编辑的历史上留下了短暂绽放的瞬间。