2.4　革命时代的来临：CRISPR技术

TALEN的发现始于细菌学家Ulla Bonas对黄单胞菌的研究。与TALEN的发现十分相似，CRISPR的发现也与细菌学家的基础研究息息相关。CRISPR的全称非常的佶屈聱牙：簇状规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）。虽然这个名字的意义较难理解，但是，从字面上可以看出，这是源于对细菌DNA上一段序列的描述。这个发现，要从1987年说起。

1987年，日本大阪大学的分子生物学家石野良纯（Yoshizumi Ishino）在研究大肠杆菌基因组的时候，发现了一些奇怪的重复结构，这些重复序列长29个碱基，反复出现了5次，并且两两之间被32个碱基组成的杂乱序列分隔[16]。在当时，科学家们对这种现象一头雾水，也没有引起重视。然而，就在5年多以后的1993年，类似的重复序列在数种细菌中被多个研究团队发现[17-19]，包括结核分枝杆菌和地中海嗜盐菌。在解开这些重复序列之谜的工作中，西班牙科学家Francisco Mojica做出了重大的贡献。在此后的研究中，他利用了生物信息学工具在DNA数据库中发现了多达20种的微生物基因组中包含这种重复序列[20]。在2001年，Mojica和同事Ruud Jansen一起，决定把这种重复序列命名为CRISPR。

虽然名字已经确定了，但是这段奇怪的序列到底有什么功能，科学家们对此还是一筹莫展。2002年，Ruud团队发现了CRISPR序列附近总是伴随着一系列同源基因，他们将这些基因命名为CRISPR-associated system，即cas基因。最初发现的四个cas基因被命名为cas1～cas4。它们所编码的蛋白，也顺理成章地被称为Cas蛋白。至此，CRISPR和Cas被紧紧联系了起来。2005年，同时有3个相互独立的研究团队（其中也包括Mojica的团队）发文，证实在CRISPR序列中，夹在重复序列中的看似杂乱无章的部分，实际上是来源于噬菌体的DNA！他们提出了一个大胆的假设：CRISPR-Cas很有可能是细菌抵御病毒入侵的免疫系统！细菌被病毒感染后，会把病毒的特征序列小心地处理一下并存放在自己的基因池中，以便下次再被感染的时候可以迅速识别并进行抵御。遗憾的是，3个团队的发现与假设，无一例外地被高影响因子的杂志拒稿，最终只能发表在了影响因子较低的学术刊物上[21-23]。然而，就在两年之后，对于这个假设的验证实验却堂堂正正发表在了《科学》杂志上[24]。这项研究成果并非来自大学或是研究所，而是来自Danisco，一家食品配料公司。他们在嗜热链球菌中人为添加了一段CRISPR序列，结果发现这些细菌可以抵挡与其对应的病毒的入侵。同时，他们也证明了在细菌中，这套系统是不断进化的。细菌可以不停地收集病毒的基因信息并把它们整合到CRISPR中。下次如果有同样的病毒入侵时，它们就可以对抗这些病毒了。这项发现非常颠覆人们的常识：小到微米级别的细菌这样的单细胞生物，居然也有自己的免疫系统。随后的数年中，很多研究团队开始研究CRISPR的工作机理。但直到2010年，人们才发现CRISPR序列可以被转录成RNA，而且这些RNA可以和细胞中的某些蛋白质相互结合。这些蛋白质就是Cas蛋白。如果这些RNA可以和某段DNA分子完美配对，Cas蛋白就会毫不留情地切断这段DNA分子。科学家们也发现，与CRISPR-RNA结合并发挥作用，通常需要数个Cas蛋白共同作用，想对这样一个庞大的复合体加以利用是十分困难的。但这并没有阻止人们探索的脚步。真正将CRISPR系统改编为基因编辑工具的先驱者，出现在2012年。

瑞典于默奥大学的Emmanuelle Charpentier率先在实验室中发现，在化脓性链球菌中，有一种Cas蛋白仅需与两段RNA分子结合就能完成对病毒DNA的切割任务（图2.6）。这个Cas蛋白，当时称作Csn1，就是后来鼎鼎大名的Cas9蛋白。为了进一步了解CRISPR-Cas9的结构，Charpentier在2011年3月的一次学术会议中找到了加州大学伯克利分校的结构生物学家Jennifer Doudna，并告知了她的这一发现。由于Doudna当时也在寻找CRISPR结构解析的突破口，两人一拍即合，迅速地开展了合作。工作进展飞速，2012年，两人在《科学》杂志发表论文，首次证明了CRISPR-Cas9系统作为基因编辑工具的可能性[25]。这个崭新的基因编辑系统，打破了ZFN和TALEN的壁垒，真正地实现科学家们梦寐以求的“指哪打哪”的愿望。这篇论文发表后仅数月，也就是2013年年初，有三个实验室分别证明了人工设计的CRISPR序列也可以进行高效的基因编辑，而且完全可以应用在哺乳动物细胞中。这包括Doudna团队[26]，还包括哈佛大学医学院的George Church团队[27]和张锋课题组[28]。随后，利用CRISPR技术制作基因编辑小鼠技术也被迅速发表[29,30]。值得一提的是，这两篇论文的第一作者，杨辉和王皓毅现在已经成为我国基因编辑领域中的佼佼者。

图2.6　CRISRP-Cas9基因编辑系统示意图

2013年是CRISPR技术爆发的一年，也是对CRISPR技术的专利进行激烈争夺的开始。2014年4月15日，美国专利与商标局将CRISPR-Cas9技术的第一项专利颁给了张锋和他所在的博德研究所。这项专利涵盖了CRISPR-Cas9技术在真核生物方面的应用。然而，从时间上来看，是Doudna和Charpentier首先发表了论文。而且她们于2012年5月就已经提交了专利申请，而张锋的专利申请提交则是在2012年12月。表面上来看，无论是学术还是专利，Doudna和Charpentier都先了一步。但是，博德研究所在提交专利时，多付了70美元的申请费而加入了所谓的“快速审查通道”，使自己的专利早于Doudna和Charpentier被审核。按照美国的专利申请法，就造成了先前提到的结果。加州大学方面当然对这个结果非常不满，迅速提起了上诉，开始了旷日持久的官司大战。当然，这也不是本书要讨论和介绍的内容了。对于专利的争夺还在争分夺秒地进行，到2019年12月为止，博德研究所已经获得了13项与CRISPR技术相关的重要专利，而加州大学也获得了3项CRISPR技术专利。